三水白虎汤抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点研究

摘要

研究背景:类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎症为中心病理的自身免疫病，其突出病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质，最终导致关节破坏畸形。RA滑膜成纤维细胞(FLS)大量增生并伴随大量炎症细胞浸润和新生血管形成是滑膜增生的基础，而RA-FLS增生的机制主要有二类，一是受多种致炎因子所驱动的炎症性增生（被动性增生），这其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)起到主要作用;二是由于RA-FLS本身的细胞生物学特点发生改变，生长周期调控机制障碍，出现类似肿瘤样转化的转化细胞特征所致（主动性增生）。RA-FLS与正常人和其它关节炎滑膜细胞相比，其生物学特点产生了明显的转化细胞特征。RA的治疗目标近年来已逐渐集中到真正阻断滑膜增生和骨质侵蚀方向，即所谓阻断病情进展。近年来针对致炎因子所致的被动性增生治疗靶点的生物制剂研究取得了较多成果，当前广泛应用的TNF-α拮抗剂能显著控制RA的症状，并部分阻断滑膜增生进程;IL-1拮抗剂已经在临床上用于RA的治疗，还在临床试验阶段的如IL-6、IL-17拮抗剂也显示出良好的治疗效果。同时处于实验阶段的转基因治疗方法即是以抑制或阻止RA-FLS主动性增生为目标，也已显示出良好的治疗效果。如转染fasl及fas相关性死亡决定蛋白(FADD)、NF-kb抑制蛋白（IkappaB）基因、阴性突变型原癌基因raf和myc等能诱发滑膜细胞大量凋亡，滑膜增生和软骨侵蚀显著受抑，甚至滑膜组织消失。
　　 类风湿关节炎属于中医“痹病”、“历节”范畴。活动期中医病机主要是湿热痹阻、痰凝血瘀。根据上述病机以及我们多年的临床经验，研制了三水白虎汤，由《千金》犀角散《广济》白虎方化裁而来，主要药物有其药物组成有:生地、水牛角、丹皮、寒水石、知母、青蒿泄热透毒;虎杖、苡仁、白芥子、独活、细辛除湿消肿;桑枝、鸡血藤、蜈蚣、全蝎、地龙、南蛇藤、甘草通络止痛。全方共奏清热透毒、除湿消肿、通络止痛之功效。该方目前在我科广泛应用于RA、OA、成人Still's病以及少年类风湿关节炎（包括系统型及少关节类型）活动期的治疗，并取得了不错的临床治疗效果。一直以来，我们对该方进行了一系列的研究，从既往的药理结果分析，该方的作用机制无疑是多途径、多层次干预RA免疫炎症的反应的多个环节。既能抗炎镇痛、又能抑制免疫，同时还有一个重要的作用是抑制滑膜成纤维细胞的增殖。三水白虎汤抑制RA-FLS增生的途径可能既能抑制炎症驱动的被动增生，又能抑制RASFs因转化而出现的主动增生。根据我们前述的研究结果，三水白虎汤抑制被动增生的作用靶点可能主要是抑制了TNF-a的生成，并抑制了TNF-α下游信号传导分子NF-kβ和p38 MAPK信号通路。但复方中药的药理作用具有多靶点性，三水白虎汤抑制RA-FLS主动增生及被动性增生的其它靶点仍未明。
　　 蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。
　　 蛋白质组学技术是基于蛋白质组学研究而发展起来的研究蛋白质生物化学性质的一系列新兴技术，通过在蛋白水平上对机体在生理和病理状态下蛋白质表达的不同以及对相关蛋白进行分类鉴定，进而从蛋白质水平上阐明疾病的发生、发展及转归的机制。通过将混合物中的蛋白质分离出来，再对这些不同蛋白质进行鉴定和比较，从而确定其浓度差异和（或）转录后修饰的差异。蛋白组学研究中的三大支撑技术为双向电泳、生物质谱、计算机图像分析与大规模数据处理技术。蛋白质组学技术的应用为RA的研究提供了一个新的手段。近几年来，国内外学者应用双向凝胶电泳(2-DE)和质谱技术对RA患者血清、血浆、滑液、滑膜组织及滑膜细胞进行蛋白质表达的种类和含量的研究，获得RA患者与健康对照人群间差异表达的蛋白质，并对某些蛋白进行了功能分析，从而推测RA早期诊断的可能生物标志。
　　 蛋白质组学这一研究手段在国内的复方中药药理研究中已有诸多报道，利用该技术对中药复方进行多靶点的高通量筛选，可以将中药复方的多组分、多靶点、多途径特点与蛋白质表达相关联。另一方面通过蛋白质表达谱的差比性分析，还可以揭示中药复方的作用靶点、作用环节和作用过程，发现复方中的有效成分及各成分间的协同关系，进一步实现复方的优化组合。一系列的研究成果对我们利用蛋白质组学技术开展对复方三水白虎汤治疗RA的药理研究具有重要借鉴意义。同时在试图阐述中药治疗RA的改善病情作用机理的实验研究中，既往有不少工作观察了中药及复方对体外滑膜细胞培养、多种细胞因子以及信号传导通路的影响，但这些作用更多只是结果，并不是真正的药物作用靶点。本项目首次以筛选三水白虎汤作用于RA滑膜细胞的靶点蛋白为目标。同时鉴于复方中药的药理作用具有多靶点性，这也是复方中药药理研究的难点，为了缩小筛选范围，本研究围绕SSBH抑制RA-FLS增生这一重要药理环节来寻找靶点，这样既突出了SSBH的优势，又大大增加了技术上的可行性。
　　 本研究通过三水白虎汤含药血清干预类风湿关节炎(RA)、骨关节炎(OA)患者的关节滑膜成纤维细胞，观察该方对细胞增殖抑制情况，同时通过检测培养细胞上清中IL-6、IL-17水平及双向凝胶电泳结合质谱技术分析含药血清干预后FLS蛋白表达图谱，并筛选出与正常对照的差异表达蛋白质点，寻求该方抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用靶点，进一步探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。
　　 第一章三水白虎汤对关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响
　　 研究目的:观察三水白虎汤(SSBH)含药血清对体外培养的滑膜成纤维细胞(FLS)增殖的影响，探讨SSBH治疗RA的作用机制。
　　 材料和方法:滑膜组织来自南方医院脊柱骨科收治行膝关节置换术确诊的RA、OA患者共6例（每组3例）。组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS，体外培养传代，并通过倒置显微镜、流式细胞术、免疫细胞化学染色等方法进行鉴定。取3～6代细胞，MTT法连续检测不同浓度(10％～30％)的含药血清干预不同时间(24、48、72h)后对FLS增殖的影响，并绘制细胞生长曲线。以来氟米特和生理盐水含药血清作对照。
　　 统计学处理:采用SPSS13.0软件进行分析，用均数加减标准差（(x)±s）表示，多组间均数的比较采用One Way ANOVA单因素方差分析，多组间均数的两两比较采用Bonferroni法。α=0.05。
　　 结果:
　　 1.FLS的原代培养采用组织块培养法2～3d后见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，一周后细胞生长迅速，约2-3W长满培养瓶底的70％-80％。
　　 2.FLS的鉴定在倒置显微镜下，所培养(RA、OA)细胞形态符合成纤维细胞的形态特征，呈纺锤状、星形或梭形，部分可呈大多角形。细胞核边界清楚，呈卵圆形，位于细胞的中间，核仁清晰。Vimentin、CD68免疫细胞化学染色结果显示Vimentin染色阳性，胞浆内见大量棕黄色颗粒，CD68染色阴性。流式细胞术检测FLS CD55+细胞百分率为（98.4±2.29）％。
　　 3.MTT法检测FLS的增殖率MTT结果显示SSBH含药血清可呈剂量和时间依赖性抑制RA、OA FLS的增殖。不同浓度(10％～30％)的SSBH干预FLS72h后，RA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.7％、42.9％、42.7％(p＜0.001);OA-FLS细胞增殖抑制率分别为24.9％、47％、48％(p＜0.001);20％的含药血清干预FLS不同时间(24、48、72h)后，RA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.3％、28.4％、42.9％(p＜0.001); OA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.7％、33.9％、47％(p＜0.001)。不同浓度(10％～30％)的来氟米特(LEF)干预FLS72h后，RA-FLS细胞增殖抑制率分别为9.9％、39％、38％(p＜0.001); OA-FLS细胞增殖抑制率分别为26.8％、40％、40.8％(p＜0.001);20％的来氟米特(LEF)干预FLS不同时间(24、48、72h)后，RA-FLS细胞增殖抑制率分别为15.5％、22.3％、39％(p＜0.001); OA-FLS细胞增殖抑制率分别为11.2％、26.1％、40％(p＜0.001)。无论是来源于RA还是OA，SSBH和LEF含药血清作用于滑膜成纤维细胞48h后即表现出对细胞增殖的显著抑制作用，72h达到高峰。对两种来源的FLS，LEF与SSBH含药血清的抑制效率大致相当。
　　 结论:中药复方三水白虎汤能有效抑制关节炎滑膜成纤维细胞的增殖，这可能是该方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。
　　 第二章三水白虎汤对关节炎滑膜成纤维分泌IL-6、IL-17的影响
　　 研究目的:观察三水白虎汤(SSBH)含药血清对体外培养的关节炎(RA、OA)患者滑膜成纤维细胞(FLS)分泌IL-6、IL-17的影响，探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。
　　 材料和方法:组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS，体外培养传代，取3～6代细胞，加入20％含药血清培养72h后收集各培养细胞上清液，以来氟米特和生理盐水含药血清作对照。ELISA法检测上清液中IL-6、IL-17的水平。操作严格按照试剂盒操作说明进行。最后于全自动酶标仪读取A450值，根据标准反应曲线求得样品IL-6、IL-17的水平。
　　 统计学处理:采用SPSS13.0软件进行分析，用均数加减标准差（(x)±s）表示，α=0.05。
　　 结果:SSBH和来氟米特(LEF)均可显著抑制RA-FLS上清液中IL-17的含量，与生理盐水(NS)对照组比较有显著性差异;但SSBH与LEF两组比较没有显著差异。SSBH与LEF对RA-FLS上清液中的IL-6含量却无显著影响。SSBH含药血清对OA-FLS的IL-6和IL-17分泌量均未见明显影响。
　　 结论:中药复方三水白虎汤能显著抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞分泌IL-17，这可能是该方治疗类风湿关节炎的药理机制之一。
　　 第三章三水白虎汤抑制关节炎滑膜成纤维细胞增殖的蛋白质组学研究
　　 研究目的:应用蛋白质组学技术分析三水白虎汤(SSBH)含药血清对体外培养的关节炎(RA、OA)滑膜成纤维细胞(FLS)蛋白表达差异并对差异蛋白加以鉴定，以期探寻SSBH抑制FLS增殖所表现出功能特性的分子基础，进一步探讨该方治疗类风湿关节炎的作用机制。
　　 材料和方法:组织块培养法收集RA、OA患者的关节FLS，体外培养传代，取3～6代细胞，加入20％SSBH含药血清培养，以加入生理盐水制备的血清作对照，培养72h后，提取细胞总蛋白，用双向凝胶电泳(2-DE)分离细胞总蛋白，凝胶经银染显色和图像数据分析识别差异蛋白位点;将这些差异点进行胶内原位酶解及利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。
　　 结果:RA患者和对照组FLS的2-DE图谱分别显示出833、859个蛋白质点。OA患者和对照组FLS的2-DE图谱分别显示出936、968个蛋白质点。对二者相互匹配的蛋白质点进行差异分析，以差异量大于3倍的表达量为准，在RA-FLS中初步筛选出16个差异表达的蛋白质斑点，其中表达上调和高丰度表达的蛋白有7个，下调表达的9个。在OA-FLS中初步筛选出24个差异表达的蛋白质斑点，其中表达上调和高丰度表达的蛋白有11个，下调表达的13个。将这些差异点进行MALDI-TOF-MS分析，成功鉴定出26个点，其中在RA-FLS中，SSBH下调Centrosomal（中心体蛋白）;GSS（谷胱甘肽合成酶蛋白）;Microtubule-associated serine/threonine-protein（微管相关性丝氨酸/苏氨酸蛋白）;Desmoplakin（桥粒斑蛋白）;Interleukin-3 receptor(IL-3受体蛋白);DST（肌动蛋白结合蛋白）;Exocyst（泡外蛋白）;Centrosome-associated(中心体关联蛋白);上调Protein OS-9; Sorcin(抗药蛋白);Interleukin-1 receptor antagonist(IL-1受体拮抗蛋白)等蛋白的表达。在OA-FLS中，SSBH下调Sulfatase-modifying factor2（硫酸酯酶修饰因子2）;Coiled-coil domain-containing protein（卷曲螺旋包含域蛋白）;Desmoplakin（桥粒斑蛋白）;Centromere-associated(着丝粒相关蛋白);Sickle tail protein homolog(镰刀尾蛋白同系物);acidic ribosomal（酸性核糖体蛋白）;上调Myosin-Ⅰc（肌球蛋白-Ⅰc）;RABGAP1L(Rab蛋白GTP酶激活蛋白1);Centrosomal（中心体蛋白）;Rootletin（小根蛋白）;inosine triphosphatepyrophosphatase(肌苷焦磷酸酶); Myosin-Ⅲa(肌球蛋白Ⅲa);Translocon-associated protein subunit delta（易位子相关蛋白亚基）;dioxygenase（双加氧酶）;Coiled-coil domain-containing（卷曲螺旋域包含蛋白）等蛋白的表达。
　　 结论:三水白虎汤含药血清干预关节炎滑膜成纤维细胞后，11个蛋白在RA滑膜成纤维细胞中表达明显变化，15个蛋白在OA滑膜成纤维细胞中表达明显差异。这些蛋白涵盖结构蛋白、信号转导相关蛋白、信号分子、细胞代谢相关蛋白质等，我们推测这些分子中部分可能与三水白虎汤抑制滑膜成纤维细胞增殖有关，可能是该方治疗类风湿关节炎的作用机制之一。

目录

摘要

第一章 前言

1 类风湿关节炎概述

2 三水白虎汤抑制RA滑膜增生的疗效、药理作用及干预机制

3 蛋白质组学技术及其在RA研究中的应用

第二章 SSBH对FLS增殖的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 SSBH对FLS分泌IL-6、IL-17的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第四章 FLS的蛋白质组学研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

英文缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢

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