抗凋亡蛋白Bcl--XL的表达在前列腺增生衰老逃逸机制中的作用探讨

摘要

研究背景: 良性前列腺增生(BPH)简称前列腺增生，是困扰老年男性的一个常见疾病，在我国随着人均寿命的延长、生活质量的提高及生活环境的变化，其患病率已接近发达国家。尽管前列腺增生的发病率呈逐年上升的趋势，但其发病机制尚待明确。虽然手术治疗是目前治疗前列腺增生较为理想的手段，但该病的患者均为高龄人群，因此相当一部分病人不能耐受手术。如能够从基因水平分析其发病机制，找到发病的关键位点并进行靶向治疗，则对于治疗这部分病人并且减轻社会负担有着重大和积极的意义。 对于前列腺增生病因的研究从最初的组织形态到细胞，再到深入至分子领域，不同的研究方法和实验模型的建立使得与前列腺增生的基因和细胞因子不断地被发现。在研究方向上主要集中于增殖、分化、凋亡和衰老四个方面，在理论上陆续提出了雄雌激素失调、胚胎再唤醒及多肽类生长因子作用等学说。一般情况下，人的组织器官会随着人体的衰老而退化，表现为细胞增殖能力的下降、组织器官体积的萎缩，而前列腺却表现相反，随着年龄的增长表现出细胞增生、体积增大的趋势。为此，我们提出了细胞衰老逃逸机制，即细胞一方面通过对凋亡缺乏敏感性使得细胞存活更长时间，另一方面也通过延缓衰老使得细胞拥有更多的分裂次数，其总的作用导致了前列腺细胞数量上的增加。从BPH的组织学表现来看，这是前列腺增生发病机制的一个合理解释。在这个思路的指导下，我们首先研究了端粒酶在这个机制中的重要性，在正常情况下细胞中的端粒酶活性是受到严格控制的，端粒酶活性升高会使细胞端粒延长，从而使细胞增殖次数增加、寿命延长。通过检测端粒酶分别在前列腺正常和增生组织中的活性表达，发现端粒酶活性在增生组织中高于正常组织，初步得出了衰老逃逸在前列腺增生中的存在。进一步的研究我们比较了具有代表性的衰老基因p16iak4a在前列腺正常组织和增生组织中的表达情况，发现p16iak4a基因在增生组织中低表达，这种低表达可能延缓了细胞的衰老，使前列腺细胞衰老逃逸，造成积累导致组织增生。这都有力地肯定了衰老逃逸机制在前列腺发病机制中的重要性。 Bcl-xL是Bcl-2家族蛋白，在细胞凋亡调节中发挥重要作用。Bcl-xL可以和其它促凋亡蛋白形成异源二聚体而抑制细胞凋亡，也可以直接在线粒体外膜上形成寡聚体通道以在细胞应激时维持线粒体膜的正常状态。大量研究表明抗凋亡蛋白Bcl-xL在衰老的细胞当中能使细胞对凋亡作用更具有抵抗性，从而破坏正常细胞的凋亡，使得细胞存活时间延长而得以累计。前列腺增生作为一个典型的年龄相关性疾病，Bcl-xL与其的关系尚不清楚。 目前所知前列腺的生长发育过程中雄激素及其受体发挥着重要的作用，大量的研究表明增生的前列腺组织中雄激素受体的表达较正常组织明显升高。在此，将前列腺增生组织中雄激素受体与BCL-XL的表达关联性作一分析，有利于了解两者在发病机制中的相互作用，为进一步揭示发病原理提供依据。进而为前列腺增生分子靶向治疗药物的开发提供重要理论依据。 研究目的: 本实验拟通过收集增生的前列腺组织与正常的前列腺组织，检测两种组织中抗凋亡蛋白BCL-XL和雄激素受体的表达情况;分别分析抗凋亡蛋白BCL-XL与雄激素受体的表达关系、抗凋亡蛋白BCL-XL与前列腺增生发病进展危险因素的关系，为临床靶向药物治疗前列腺增生提供理论依据。 研究方法: 1.收集正常前列腺及增生前列腺的组织标本。正常前列腺标本来源于脑死亡移植肾供者，增生前列腺组织来源于耻骨上前列腺摘除术或膀胱癌根治术患者，组织经取材后均用4％的甲醛固定48小时，首先经过病理切片后进行HE染色，在显微镜下观察组织标本确定为正常组织或增生组织后，再用石蜡包埋封存，同时记录每个标本的来源、日期、分类和相关临床指标信息。前列腺增生发病进展危险因素的临床指标有年龄（岁）、体积(cm3)、前列腺特异性抗原PSA(ng/ml)、IPSS评分（分）和最大尿流率Qmax(ml/s)。包埋标本组织后的石蜡块存放于4℃的低温环境中，防止标本受损。 2.检测抗凋亡蛋白BCL-XL和雄激素受体的表达情况。石蜡块进行组织切片制成组织玻片后，依次经烤片、二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，3％过氧化氢溶液消除内源性过氧化物酶和0.01mol/L pH6.0的柠檬酸盐缓冲液微波炉高温抗原修复后进行免疫组织化学染色:用0.01mol/L pH7.2～7.4的PBS洗3次，每次3min，滴加一抗后放于4℃湿盒中过夜;再依次经封闭、滴加二抗和SABC试剂后在显微镜控制下进行DAB染色，苏木素复染;最后行脱水、透明和封片镜检。实验阴性对照组以PBS代替一抗，阳性对照组采用乳腺癌和肺癌切片对照。图像分析:所有免疫组化切片均在同一条件下采用Image pro-plus图像采集分析系统进行图像采集和分析。图像采集系统预热20分钟后，调整并固定各项设置，如光源、光圈、白平衡、曝光强度、敏感度和对比度等等，每张切片选取具有代表性地区域按3×3摄取9个高倍视野，再导入图像分析系统计算出每张切片的积分光密度值（IOD值），再用IOD值除以测量面积，得到平均光密度值（MD值）作为一个切片的最终结果。分别检测出正常前列腺组织与增生前列腺组织中抗凋亡蛋白BCL-XL和雄激素受体的表达情况后记录两组数据。 3.实验数据统计分析。将记录的各项临床指标和组织中抗凋亡蛋白BCL-XL和雄激素受体的表达情况数据综合分析，实验数据采用((x)±s)表示，使用SPSS13.0数据包进行分析，两个变量之间的相关性用Spearman等级相关分析。取P＜0.05为统计学有显著性差异。分别评估抗凋亡蛋白BCL-XL的表达与雄激素受体表达的关系、与前列腺增生(BPH)的关系和与前列腺增生进展危险因素的关系。 研究结果: 1.抗凋亡蛋白Bcl-xl和雄激素受体(AR)在前列腺组织中的表达及分布。免疫组织化学检测结果显示:在正常的前列腺组织中不管是上皮细胞还是间质细胞，抗凋亡蛋白Bcl-xl的显色微弱，证明其表达极少;而雄激素受体(AR)在上皮细胞和间质细胞中都有不同程度的表达，显色为阳性，而且在上皮细胞中的表达多于间质细胞。在增生的前列腺组织中抗凋亡蛋白Bcl-xl和雄激素受体(AR)的显色均为强阳性，说明其表达均明显，且上皮细胞的表达强于间质细胞。经检验分析发现良性前列腺增生组织中抗凋亡蛋白Bcl-xl和雄激素受体(AR)的表达均高于正常前列腺组织(P＜0.05)，而且等级相关分析显示抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达与雄激素受体(AR)的表达呈正相关。抗凋亡蛋白Bcl-xl与雄激素受体(AR)两者表达的相关系数在正常组和BPH组中分别为0.0399(P=0.1472)和0.5397(P=0.0028)，说明两者的表达在良性前列腺增生组织中明显相关。 2.良性前列腺增生(BPH)患者中抗凋亡蛋白Bcl-xl表达与临床指标的关系。本研究中的30例良性前列腺增生(BPH)患者均在标本获取的同时记录临床检测指标如下:年龄为(67.3±6.9)岁、前列腺体积为(170.1±70.7) cm3、前列腺特异抗原PSA为(3.7±6.1)ng/ml、IPSS评分(24.4±4.3)分、最大尿流率Qmax为(11.0±7.0) ml/s。采用Spearman等级相关分析后显示:抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达与患者年龄呈正相关(P＜0.05);与前列腺体积呈正相关(P＜0.05);与PSA值呈正相关(P＜0.05);与IPSS评分无明显相关性(P＞0.05);与最大尿流率Qmax无明显相关性(P＞0.05)。 结论: 本研究证明了抗凋亡蛋白Bcl-xl在前列腺增生组织细胞中的高表达及其与雄激素受体存在的正相关关系，有力支持了抗凋亡蛋白Bcl-xl可能通过与雄激素的协同作用导致前列腺细胞衰老逃逸、进而造成细胞增殖积累的推测;此外，分析发现Bcl-xl与患者年龄、前列腺体积和PSA值成正相关关系，说明了其也在一定程度上促进了前列腺增生的发展，为前列腺增生的发生发展机制提供了新的思路，并且在治疗上为可能的药物新靶点提供了理论依据。

目录

摘要

第一章 前言及背景

第一节 研究背景

第二节 细胞的衰老

第三节 细胞的衰老逃逸现象

第四节 衰老逃逸与前列腺增生

第五节 小结

参考文献

第二章 实验研究

第一节 前列腺组织标本的收集与固定

1．材料

2．标本的获取

3．组织标本的固定

4．标本快速HE染色鉴定

5．结果

第二节 组织标本的石蜡包埋

1．材料

2．步骤

3．石蜡块的保存

第三节．石蜡切片与蛋白(BCL-XL抗原和雄激素受体)表达的测定

1．材料

2．操作步骤

3．结果

4．讨论

参考文献

攻读学位期间成果

附录 衰老逃逸在前列腺增生发病机制中的研究(综述)

致谢

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