速度和位移对大鼠颈脊髓挫伤影响的实验研究

摘要

1.研究背景 脊髓损伤(SCI)是严重困扰人类健康的重大疾病，且尚无有效的治疗方法。脊髓损伤有近40％发生在颈脊髓，多由交通事故、坠落和运动损伤所致椎体骨折，造成对脊髓的压迫或挫伤[1]。脊髓损伤后常常会引起感觉和运动功能的障碍以及大小便异常等，给患者及其家属带来极大的负担，是医学领域研究的热点之一。 脊髓损伤的研究大多都是以动物模型为基础。1911年Allen首次运用了Wcight drop模型，但在重物坠落打击脊髓过程中没有生物力学参数的检测，二次反弹导致脊髓损伤的变异性大。1989年Young等人在Weight drop模型的基础上进行改进，研制了一种新的脊髓挫伤的模型(NYU Impactor)。同一时期，俄亥俄州立大学建立了一种能控制挫伤过程中生物力学参数的脊髓挫伤模型(OSUModel)，2005年Pearse等人又研制了一种新电磁驱动的脊髓挫伤装置(ESCID)，显示0.80、0.95和1.10mm的挫伤可分别导致大鼠轻、中、重度脊髓损伤。 创伤性脊髓损伤的挫伤模型多以位移或力控制脊髓损伤的程度。近年来挫伤模型的改进主要是对脊髓损伤过程中的位移和力有更好的控制，但对挫伤速度的研究较少。致伤速度在SCI机制中也能起到非常重要作用，在多个SCI动物模型，如胸段脊髓挫伤和颈椎骨折错位模型的研究中都证实了高速损伤所导致的原发性损伤更为严重。例如，Sparrey[2]等分别以300mm/s和3mm/s的挫伤速度打击胸段脊髓(T10)，发现挫伤速度越大，脊髓出血越多，轴索损伤的程度也越严重，证明了挫伤速度是评价脊髓损伤的重要参数。但Lau[3]在骨折错位模型中发现脊髓损伤的严重程度取决于错位位移，而与速度没有明显的相关性。目前尚没有在颈脊髓挫伤模型中比较速度因素的影响，需要分析更高的致伤速度对其所导致的原发性SCI，甚至是继发性SCI的影响。 2.研究目的 本研究采用电磁伺服试验机的脊髓挫伤模型，研究两种致伤速度(5mm/s和500mm/s)分别在1.1mm和1.5mm的挫伤位移下的大鼠原发性SCI，分析颈脊髓挫伤后的脊髓出血量和轴索损伤，以明确挫伤速度对大鼠颈脊髓原发性损伤的影响。 3.研究方法 3.1颈脊髓挫伤模型的建立 选取10只雄性Sprague-Dawley大鼠，体重260±10g，月龄2-3月。随机分为实验组和对照组。每组5只。采用小动物麻醉机，异氟烷气体麻醉大鼠后，用动物剃毛机将大鼠颈背部的毛发剔除。将大鼠固定在脑立体定位架仪上，用软垫将将颈椎处抬高并使头屈曲90°，消除颈曲。常规消毒铺巾，从C2下方行长约2～3cm的背侧正中切口，分离皮肤、皮下及椎旁肌肉，暴露椎板。清理C4-C7椎板，暴露横突与关节突间的沟槽，咬除C5椎板，暴露脊髓，保留硬脊膜的完整。用自制的椎夹夹持在C6和C7的沟槽内，然后将椎夹固定在脑立体定位仪上，这样可以消除大鼠由于呼吸所造成的脊髓移动。大鼠固定后连同脑立体定位仪一起移至电磁伺服材料试验机上（Instron E1000）。脊髓挫伤的打击头与OSU装置类似，为直径4mm的有机玻璃制成的平头锥形棒。将脊髓打击头移动到正对已暴露的C5脊髓硬膜，然后缓慢地将打击头下降并接触硬膜，直至接触力达到0.03N[4,5]时停止，以此定义为脊髓挫伤的初始位置。 本研究以500mm/s的速度在C5上产生1.5mm的挫伤，挫伤后打击头迅速离开脊髓表面。对照组除没有实际挫伤外，其余均与实验组相同。 检测在大鼠脊髓挫伤的过程中的生物力学参数（时间、速度、位移和力）。连接于打击头和材料试验机之间的上方通过小载荷力传感器（量程0～10N）测量挫伤过程中的撞击力。撞击力包括快速制动的惯性力和打击脊髓表面的力。本研究采用在相同状态下空打的载荷作为惯性补偿力，以除去实际打击过程中的惯性力影响。材料试验机的位移传感器给出挫伤位移和速度。 在挫伤完成后5min内行心脏灌注，后观察大鼠脊髓的大体形态，然后通过多聚甲醛液将大鼠脊髓标本固定，蔗糖溶液梯度脱水后保存。行连续矢状位冰冻切片，通过HE染色观察脊髓大体形态，计算脊髓白质、灰质和总出血量。β-APP免疫组化观察轴索损伤情况。 3.2挫伤速度和位移对大鼠颈脊髓原发性损伤的影响 本研究共选取36只雄性Sprague-Dawley大鼠，体重为260±10g，月龄2-3月。根据挫伤位移分为1.1mm组和1.5mm组，根据挫伤速度分为快速组(500mm/s)和慢速组(5mm/s)。同时设立实验对照组。 手术过程和损伤方法与前一部分相同。 采用双因素方差分析分别比较挫伤速度和位移对于大鼠颈脊髓挫伤时的生物力学参数以及损伤后脊髓灰质、白质和总出血量的影响。 4.研究结果 4.1脊髓挫伤模型的建立 在500mm/s速度的挫伤下，实验组的最大力为5.7±1.2N，实际的挫伤位移为1.49±0.03mm，挫伤速度为511±4mm/s。表明本研究对速度和位移的控制相当地精确。 肉眼下观察实验组大鼠脊髓背侧都出现两个颜色较深的出血带。在HE染色后显微镜下观察可发现实验组大鼠脊髓均有出血，且出血主要集中在脊髓灰质，白质中相对较少，且背侧较腹侧更多。实验组大鼠脊髓灰质、白质及总出血分别为0.71、0.23和0.94mm3。对照组大鼠脊髓均未出现任何出血。 β-APP免疫组化染色后发现实验组大鼠脊髓灰质和白质轴索均有断裂，均可见β-APP阳性细胞的表达。对照组大鼠脊髓轴索则很少有断裂，几乎无β-APP阳性细胞的表达。 4.2脊髓挫伤速度和位移对大鼠颈脊髓原发性损伤的影响 在1.5mm位移的挫伤下，快速组(500mm/s)和慢速组(5mm/s)的最大力分别为5.3±1.2N和2.8±0.6N，错伤位移分别为1.50±0.05mm和1.51±0.04mm，挫伤速度分别为516±11mm/s和4.8±0.5mm/s。在1.1mm位移的挫伤下，快速组和慢速组的最大力分别为5.3±3.1N和2.3±0.1N，挫伤位移分别为1.11±0.05mm和1.12±0.03mm，挫伤速度分别为469±57mm/s和4.9±0.4mm/s。 不同挫伤速度间的最大力的差异有显著性(F=21.567，P=0.000)，其中快速挫伤组的最大力大于慢速组。而不同挫伤位移间的最大力差异没有显著性(F=0.199，P=0.660)。挫伤速度和位移间的交互作用没有显著性(P=0.63)。 上述结果表明，脊髓挫伤的速度越大，其挫伤脊髓的力也越大，也即挫伤速度是导致挫伤脊髓最大力差异的因素。 大鼠脊髓挫伤后，脊髓背侧均出现了一带状出血。在脊髓打击瞬间，大鼠前肢均有一过性的搐动，显示脊髓受到机械刺激。 心脏灌注取材后，在肉眼下可以观察到挫伤后以C5为中心的脊髓表面均有一不同程度的带状出血。在同一位移的挫伤下，快速组出血带颜色较慢速组更深;在同一速度的挫伤下，1.5mm组出血带颜色较1.1mm组更深。 在显微镜下可见HE染色后1.5mm快速组脊髓出血区域大部分在灰质，白质中也可见部分出血带，且分布较散。而1.5mm慢速组脊髓出血区域绝大都集中在灰质，白质中仅可见很少量的出血。1.1mm组情况与1.5mm组类似，但出血均明显少于1.5mm组。 在1.5mm挫伤下，快速组和慢速组的白质出血量分别为0.23mm3和0.12mm3，灰质出血量分别为0.71 mm3和0.42 mm3，总出血量分别是0.94mm3和0.55mm3。在1.1mm挫伤下，快速组和慢速组的白质出血量分别为0.18mm3和0.06mm3，灰质出血量分别为0.49 mm3和0.25 mm3，总出血量分别是0.67mm3和0.31mm3。 统计分析表明不同挫伤速度下白质、灰质及总出血量的差异均有显著性，快速组各部位的出血量显著大于慢速组;不同位移的挫伤下灰质及总出血量的差异有显著性，而白质出血量的差异无显著性;1.5mm组脊髓出血量大于1.1mm组。以上结果证明挫伤速度和位移都是导致脊髓各部位出血差异的因素。脊髓挫伤速度越大，脊髓白质、灰质及总出血量越大;脊髓挫伤位移越大，脊髓各部位的出血量也越多。 β-APP免疫组化染色后的脊髓切片上可见均可见β-APP阳性细胞的表达，阳性细胞表现为一棕黄色的收缩球样，说明挫伤后大鼠脊髓的灰质和白质轴索均有断裂。无论在1.5mm组或1.1mm组，快速组中β-APP阳性细胞的数量明显多于慢速组。 5.结论 本研究结果证明大鼠C5脊髓在500mm/s的速度下挫伤1.5mm，脊髓灰质和白质均出现出血以及轴索的断裂，造成了脊髓原发性损伤，建立了大鼠颈脊髓挫伤的模型。 脊髓挫伤速度是影响脊髓原发性损伤的因素。速度越大，脊髓白质、灰质及总出血量越大;导致脊髓轴索断裂的程度也越严重。证明快速的脊髓挫伤可以导致更为严重的原发性脊髓损伤。 脊髓挫伤位移越大，脊髓各部位的出血量越多;脊髓轴索损伤程度也更为严重。说明大位移的挫伤也同样可以导致更为严重的原发性脊髓损伤。

目录

摘要

第一章 前言

1．脊髓损伤流行病学概况

2．脊髓损伤的原因与特点

3．脊髓的结构和功能

4．大鼠外伤性脊髓损伤模型

第二章 颈脊髓挫伤模型的建立

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第三章 挫伤速度和位移对大鼠颈脊髓原发性损伤的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

攻读硕士期间科研成果

参考文献

致谢

声明