乌司他丁预先给药对高糖孵育H9c2心肌细胞氧化应激损伤的影响

摘要

研究背景： 心脏缺血一段时间再恢复血流灌注后，其心肌细胞代谢功能障碍及结构破坏反而加重的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusioninjury，MIRI)，此现象主要在行体外循环的心脏手术、心肌梗死患者的溶栓治疗和冠心病患者实施非心脏手术中较为多见，其可进一步使心脏的各种危险事件发生率升高。缺血再灌注损伤是一个多因素参与的复杂过程，而机制至今仍未阐明，其中氧自由基的大量产生及心肌细胞凋亡却是造成损伤的重要因素。目前，活性氧(ROS)和氧自由基被认为是导致细胞凋亡的重要因素。在心脏缺血再灌注时产生的氧化应激损伤中，它们对心脏的病理生理改变起到至关重要的作用。因此，如何减少围手术期氧自由基的产生和心肌细胞凋亡的发生是预防心肌缺血再灌注损伤、挽救患者生命的一个重要环节，也是一项重的研究课题。 糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种代谢性疾病，主要表现为患者体内的糖代谢和胰岛素分泌异常。糖尿病心脏病是由于患者处于持续高糖状态，心肌细胞过度地受到氧化应激而发生凋亡，最终引起心功能的损伤。不少研究也表明，持续高糖环境时各种细胞凋亡信号通道被激活而诱发心肌细胞的凋亡。围手术期的手术创伤产生的过度应激反应又可增加糖尿病患者围手术期心脏危险事件的发生率，从而增加其致残率和死亡率。 乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂，临床上应用广泛，如用于治疗急性胰腺炎、急性循环衰竭、抵抗手术侵袭、改善手术预后、改善重要器官缺血再灌注损伤、器官移植手术、体外循环手术等方面。许多临床及动物实验发现，乌司他丁可能通过改善心功能的损伤，减少氧自由基、炎症介质及细胞的凋亡等机制，从而对缺血再灌注性心肌损伤具有良好的保护作用。但目前关于乌司他丁对心肌缺血再灌注损伤的研究都处于体内研究，未能排除神经和体液的影响，其在离体心肌细胞凋亡方面的影响研究还未见报导。本课题旨在利用过氧化氢(H2O2)诱导性H9c2细胞氧化应激损伤模型，在细胞水平模拟体内心肌缺血再灌注时产生的氧化应激损伤，并观察乌司他丁对高糖环境下H9c2细胞受到H2O2急性氧化应激诱导的细胞凋亡的影响，并初步探讨其与PI3K/Akt、Erk及Jnk等信号通路的关系。 目的： ①通过对各种指标的检测评估氧化应激过程对H9c2细胞造成的损伤。 ②评价不同剂量的乌司他丁预先给药对氧化应激损伤后的H9c2细胞有无保护作用，并选择最合适的剂量。 ③研究乌司他丁预先给药对H9c2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制:其是否具有抗凋亡作用;其是否通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax的表达来减少细胞凋亡;其是否与PI3K/Akt、Erk和Jnk等信号通路有关。 ④研究乌司他丁预先给药对高糖孵育下心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。 方法: 1.细胞氧化应激损伤模型制作: 于37℃、5％CO2细胞培养孵箱中，加入含10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM细胞培养液培养H9c2心肌细胞株。待细胞的生长处于对数生长期时进行实验处理，PBS液洗2次后随机分组。氧化应激组细胞加入含500μmol/LH2O2的低血清DMEM(2％FBS)培养液于孵箱中培养24h，正常对照组细胞只加入低血清DMEM(2％FBS)培养液培养24h，处理结束后收集标本进行各种指标检测。 2.分组 第一部分分组: 细胞于96孔板和6孔板内培养，然后随机分为正常对照组(NC组)、氧化应激模型组（H组）、乌司他丁组（U组）和乌司他丁预先给药组(UH组)。实验时换入2％低血清培养基，NC组换入低血清培养基培养48h;H组前24h低血清培养基培养，后24h换入含500μmol/L H2O2的低血清培养基处理;U组换入含乌司他丁400U/ml低血清培养基培养48h; UH组前24h于含400U/ml乌司他丁的低血清培养基中培养，后24h换入含400U/ml乌司他丁及500μmol/LH2O2低血清培养基继续培养。各组细胞共48h实验处理后收集标本。 第二部分分组: 细胞培养于6孔板和T-75培养瓶内，随机分为正常对照组(NC组)、氧化应激模型组（H组）、乌司他丁预先给药组（UH组）、抑制剂+氧化应激组(LYH组或PDH组)和抑制剂+乌司他丁预先给药组(LYUH组或PDUH组)。LY294002和PD9059分别是PI3K/Akt信号通道和Erk1/2信号通道的特异性抑制剂。抑制剂+氧化应激组在前24h加入含10μ mol/L抑制剂低血清培养基处理，后24h换入含抑制剂及500μmol/LH2O2低血清培养基中继续培养;抑制剂+乌司他丁预先给药组前24h加入含抑制剂及400U/ml乌司他丁的低血清培养基培养，后24h换入含抑制剂、400U/ml乌司他丁及500μmol/L H2O2低血清培养基中继续培养:其余各组的处理同第一部分。 第三部分分组: 细胞培养于96孔板和6孔板内，实验随机分6组:正常糖对照组(NC组):低糖（5.5mmol/L）低血清(2％FBS)培养基孵育细胞48h;正常糖氧化应激组（H组）:低血清培养基孵育24h后加500μmol/L H2O2继续刺激24h;正常糖乌司他丁预先给药组（UH组）:低血清培养基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/L H2O2继续刺激24h;高糖对照组(HC组):换入(25mmol/L)高糖低血清培养基，继续孵育48h;高糖+氧化应激组（HH组）:高糖低血清培养基先孵育24h后再加入500μmol/L H2O2继续刺激24h;高糖+UTI+氧化应激组（HUH组）:高糖低血清培养基中加400U/ml UTI孵育24h后再加500μmol/LH2O2继续刺激24h。各组细胞共实验处理48h后收集标本。 3.实验指标及技术 (1)显微镜下观察细胞形态于6孔板内培养的心肌细胞经实验处理后，吉姆萨染色后于倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态变化。 (2) MTT法测定细胞活力96孔板内心肌细胞实验处理后，每孔换入200μl的低血清培养液和5mg/ml MTT液20μl后继续孵育4h，弃上清，分别再加入150μl DMSO液，轻轻震荡10min后使紫色结晶充分溶解，酶标仪测定各孔波长在490nm(A490)的吸光度（OD值），细胞存活率计算公式:细胞存活率=OD处理组/OD正常组×100％。 (3) LDH、SOD、MDA与caspase-3检测实验处理后，收集各组96孔板中培养液，按LDH试剂盒的说明书进行检测及计算。酶消化法收集实验处理后各组6孔板中的细胞标本，BCA法或考马斯蓝法测定各组细胞的蛋白浓度，分别按SOD、MDA与caspase-3试剂盒的说明书进行检测及计算。 (4)流式细胞仪测定细胞凋亡率实验处理后酶消化法收集细胞及培养液，于常温离心机1000g离心5min，弃上清后PBS液重悬细胞再离心，重复2次，细胞再重悬后调整细胞计数至105个/ml，按AnnexinⅤ-FITC/PI双标记法染色处理细胞后于流式细胞仪进行细胞凋亡检测。 （5) Western Blot方法测定蛋白表达量实验处理后收集各组细胞标本，酶消化法收集并提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取相同蛋白量样品和上样缓冲液调整到相同体积后上样，于10％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转法将分离的目的蛋白转印至PVDF膜上，于5％脱脂奶粉中室温封闭1h左右后，对应的一抗4℃孵育过夜，洗涤后二抗室温孵育1h，ECL显色，于暗室中X光胶片曝光，预染蛋白Marker确定目的条带。 结果： 1.细胞形态的变化 吉姆萨染色后倒置显微镜下观察:NC组细胞生长密度高，呈短梭型紧密生长，边界清楚，贴壁较牢;氧化应激H组细胞生长密度低，细胞间隙增宽，可见大片脱失区，部分细胞收缩变圆，细胞核固缩呈深蓝色，甚至可见细胞碎片;U组形态与NC组相似，而UH组细胞密度较H组高，脱失区面积小，细胞边界较清楚。 2.细胞活力的变化 氧化应激损伤可使细胞活力显著下降，且随着H2O2浓度升高，细胞活力逐渐降低。500μmol/L的H2O2浓度用作建立氧化应激模型，其细胞活力较NC组的显著降低，仅为NC组的52.7±0.7％（P=0.00）。乌司他丁与心肌细胞共同孵育下，随着乌司他丁浓度的增加，药物对心肌细胞增殖的抑制作用不断增大，细胞活力逐渐降低。而与H组比较，400U/ml乌司他丁随着预先给药时间的延长，其细胞活力逐渐升高，差异有统计学意义(P=0.00)。 与低糖(5mmol/L)组比较，随着糖浓度的增加，心肌细胞存活率逐渐下降，差异有统计学意义(P=0.00)，具有浓度依赖性。与HH组比较，HUH组的细胞存活率明显升高(P=0.00)。 3.LDH、SOD、MDA、caspase-3与细胞凋亡率的改变 与NC组比较，氧化应激损伤可使培养液中LDH活力、细胞内MDA含量、caspase-3表达及细胞凋亡率显著增多，而细胞内SOD活性下降，且差异有统计学意义(P＜0.01)。与H组比较，乌司他丁预先给药组培养液中LDH活力、细胞内MDA含量、caspase-3表达及细胞凋亡率都明显降低，细胞内SOD活性升高（P＜0.01）。 4.高糖环境对心肌细胞氧化应激损伤后MTT、LDH、SOD、MDA及细胞凋亡率的影响 与正常糖组比较，高糖环境可造成心肌细胞一定程度的损伤，细胞内SOD活性降低而MDA含量增多(P＜0.01)，而其他指标的差异无统计学意义;高糖环境下过氧化氢诱导细胞氧化应激可导致明显的细胞损伤，细胞存活率及细胞内SOD活性下降，培养液中LDH活力、细胞内MDA含量及凋亡率增多(P＜0.01)。与HH组比较，乌司他丁预先给药组中的培养液LDH活力、细胞内MDA含量及细胞凋亡率都明显降低，而细胞内SOD活性升高（P＜0.01）。 5.细胞内目的蛋白表达的变化 Western结果显示，与NC组比较，H组和UH组的bcl-2表达量显著降低，bax及p-Jnk表达量增多，而总Jnk量无明显差异，bcl-2/bax比值降低而p-Jnk/Jnk比值升高(P＜0.01);与H组比较，UH组的bcl-2/bax比值升高而p-Jnk/Jnk比值降低(P＜0.01)。 加入PI3K/Akt特异性抑制剂组中，与NC组比较，其余各组的p-Akt的表达量均增多，而总Akt量无明显差异，p-Akt/Akt比值升高(P＜0.01)，其中HU组的值最大，LYHU组次之，随后是LYH组及H组，组间差异明显(P＜0.01);LYHU组p-Akt/Akt比值较HU组的降低而较H组的升高(P＜0.01)，故PI3K/Akt抑制剂未能完全阻断乌司他丁引起的作用。 加入Erk1/2特异性抑制剂组中，与NC组比较，其余各组的p-Erk1/2的表达量均增多，而总Erk1/2量无明显差异，p-Erk/Erk比值升高(P＜0.01)，其中HU组的值最大，PDHU组次之，随后是H组及PDH组，组间差异明显(P＜0.01);PDHU组p-Erk/Erk比值较HU组的降低而较H组的升高(P＜0.01)，故Erk1/2抑制剂也未能完全阻断乌司他丁引起的作用。 6.相关性分析 相关性分析结果表明，SOD活性与细胞存活率呈正相关，与凋亡率、MDA含量及LDH活性呈负相关;而MDA含量与存活率呈负相关，与凋亡率及LDH活力呈正相关(P＜0.01)。 结论： 本实验通过过氧化氢诱导心肌细胞造成氧化应激损伤模型，模拟心肌缺血再灌注后细胞的氧化应激损伤，通过观察细胞形态及测定细胞存活率、抗氧化指标、细胞凋亡率及部分信号传导通路蛋白的变化，得出如下

目录

摘要

第一部分 乌司他丁预先给药对H9c2细胞氧化应激损伤的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二部分 乌司他丁预先给药对H9c2细胞氧化应激损伤中PI3/Akt、ERK和JNK等信号通路的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三部分 乌司他丁对高糖孵育下H2O2诱导性H9c2细胞氧化应激损伤的影响

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

参考文献

结论

中英文缩写对照表

攻读学位期间的成果

致谢

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