E3泛素连接酶HERC4在乳腺癌中的表达及其功能研究

摘要

乳腺癌发病率及死亡率高，已经成为威胁现代女性健康排名第一的恶性肿瘤。与发达国家相比，中国乳腺癌发病率虽然相对较低，但近年来有明显增长趋势。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示:女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计约为43/10万，城市为52/10万，农村为23/10万。过去数十年，虽然对于乳腺癌的临床研究取得了较大进展，但乳腺癌的发病机理尚不完全清楚。总的来说，乳腺癌的发生与基因组不稳定和突变有密切关系，基因表达失控和蛋白调节紊乱现象的积累最终导致了乳腺癌的发生与发展。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system， UPS)在调节体内蛋白质动态平衡从而调控一系列生理过程中起到了重要的作用。除此之外，越来越多的证据表明，UPS功能失调与乳腺癌的发生、发展密切相关。因此，从UPS功能失调方面去揭示乳腺癌发生过程中的基因表达失控和蛋白调节紊乱的原因，将有助于进一步阐明乳腺癌的发病机制，从而为乳腺癌的早期诊断和靶向治疗提供线索。 E3泛素连接酶是对底物蛋白具有特异性识别作用的酶类，在泛素化途径中起到关键作用。目前主要将E3泛素连接酶分为三大类:HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box结构域家族。HECT结构域与对于底物蛋白p53有泛素连接酶活性的E6相关蛋白的羧基端(carboxyl-terminal region E6-associated protein)具有50％的序列相似性。 HERC4属于HECT家族，基因定位于染色体10q21.3，全长4531个碱基，编码1057个氨基酸。Hochrainer于2005年首次鉴定出HERC4具有泛素连接酶活性。然而HERC4在肿瘤中的生理功能和下游作用的靶分子尚无公开报道。 因此，本研究通过基因表达分析、干扰HERC4分析、基因芯片分析和生物信息学分析，研究HERC4在乳腺癌组织中的表达，分析其与乳腺癌的关系，探讨HERC4的生理功能以及其参与乳腺癌发生的分子调控网络。本文的研究内容主要包括以下4个部分: 第一部分:HERC4在乳腺癌组织中的表达及临床意义。我们首先通过实时荧光定量PCR和western blot检测32对新鲜乳腺癌组织（13例导管内癌，19例浸润性导管癌）和配对癌旁乳腺组织mRNA和蛋白表达水平，分析组间表达差异。并用组织芯片和免疫组织化学的方法检测164例甲醛固定石蜡包埋的乳腺（癌）组织标本中（16例癌旁乳腺组织，13例良性纤维瘤，15例导管内癌和120例浸润性导管癌）HERC4蛋白表达水平，并用ROC曲线分析HERC4高表达的最佳取舍点（cut-off值），分析其在乳腺癌组织中的表达情况以及其与临床病理的联系。实时荧光定量PCR结果显示，HERC4 mRNA在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁乳腺组织，平均提高6.38倍，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。western blot结果与实时荧光定量PCR结果较为一致，配对样本t检验分析显示HERC4蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁乳腺组织，平均提高2.83倍，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化结果显示:HERC4的表达主要定位于细胞质中。根据临床病理资料（pT分期、pN分期、临床分期、组织学分级以及ER、PR、Her2、p53、Ki67表达状态）绘制出的ROC曲线结果，认为HERC4表达阳性的肿瘤细胞在所有肿瘤细胞数中所占比例超过60％为高表达。基于最佳取舍点统计，癌旁乳腺组织HERC4高表达率为6.3％，良性纤维瘤为23.1％，导管内癌为40％，浸润性导管癌为55％，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。通过进一步分析120例浸润性导管癌中HERC4的表达和临床病理参数之间的关系，结果显示HERC4在浸润性导管癌中的表达与临床分期、组织病理学分级、pT分期以及淋巴结转移正相关(P＜0.05)，而与患者年龄以及ER、PR、Her2、p53和Ki67的表达状态无显著相关性。 第二部分:HERC4在乳腺癌细胞系中的表达。乳腺癌细胞系是体外研究乳腺癌的细胞模型，不同的乳腺癌细胞系一定程度上代表了不同肿瘤亚型。我们通过实时荧光定量PCR和western blot法检测并比较了5种乳腺癌细胞系与非致瘤性乳腺上皮细胞系中HERC4的mRNA和蛋白表达水平是否存在异常。实时荧光定量PCR结果使用2-△△CT值计算相对表达量，western blot结果使用目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值计算相对表达量。结果表明，实时荧光定量PCR和western blot结果比较一致。HERC4在6种细胞系中均有表达，在非致瘤性乳腺上皮细胞系MCF-10A中低表达，在除BT-474外的4种乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231、T-47D和SK-BR-3）中高表达，尤其在MCF-7中的表达量最高。结果表明HERC4在乳腺癌细胞中高表达，同时我们筛选出了HERC4表达较高的乳腺癌细胞系MCF-7，用作后续RNA干扰实验的材料。 第三部分:RNA干扰抑制HERC4表达对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖能力的影响。因MCF-7细胞HERC4表达较高，设计3对靶向HERC4的siRNA，采用脂质体转染法干扰细胞内源性HERC4表达，通过实时荧光定量PCR筛选出最优干扰条件用于下一步实验。采用上述最优转染条件转染MCF-7细胞后，实时荧光定量PCR和western blot验证干扰效率。在转染60 h后收集细胞经碘化丙啶染色后进行细胞周期检测;分别在转染0h，24 h，48 h，72 h后通过MTT法进行细胞增殖检测。实时荧光定量PCR结果显示HERC4-si-2干扰序列于转染24h时具有最强的干扰效率。MTT实验结果表明降低HERC4的表达能够对乳腺癌细胞系MCF-7的增殖产生抑制作用。细胞周期检测的结果表明下调HERC4的表达水平能够使MCF-7细胞阻滞在G1期。 第四部分:RNA干扰抑制HERC4表达对人乳腺癌细胞系MCF-7基因表达谱变化分析。采用Arraystar Human LncRNA Microarray v2.0芯片，同时检测成功干扰MCF-7细胞HERC4表达后mRNA和LncRNA表达差异。DAVID在线软件GO分析模块分析差异表达mRNA所涉及的基因功能;pathway分析差异表达mRNA所涉及的可能信号通路。使用GENCODE注释分析差异表达增强子样 LncRNA（enhancer-like LncRNA），参照John Rinn实验室发表的文章分析差异表达基因间LncRNA(LincRNA)和HOX LncRNA。并对差异表达LncRNA重新绘图，进行增强子样LncRNA和LincRNA与邻近编码基因（距离＜300kb）的共表达分析。使用实时荧光定量PCR法验证基因芯片表达数据。芯片杂交数据表明下调MCF-7细胞中HERC4基因表达后共有829个mRNA表达发生变化（578个mRNA上调，251个mRNA下调），841个LncRNA表达发生变化(395个LncRNA上调，446个LncRNA下调)。GO分析结果显示干扰HERC4表达后差异表达基因参与的生物过程主要涉及细胞内的信号级联反应、胞内运输、细胞死亡调节、细胞凋亡调节、程序性死亡的调节、细胞增殖调节、内环境稳态过程、囊泡运输、膜组织、细胞应激反应等过程，具有相同蛋白结合、RNA结合、蛋白质二聚体化活性、转录因子结合、碳水化合物结合、转录激活物活性、蛋白质同二聚体化活性、转录辅因子活性、转录辅激活物活性、糖结合等功能。Kegg pathway分析结果发现差异表达基因共涉及220条信号通路，其中和癌症相关通路共41条。根据GENCODE注释的增强子样LncRNA(enhancer-likeLncRNA)进行分析发现，共有26条增强子样LncRNA表达上调，21条增强子样LncRNA表达下调。随后进行的增强子样LncRNA-邻近编码基因(距离＜300kb)共表达分析发现，共有11对共表达增强子样LncRNA-邻近编码编码基因，其中5对为同方向共表达(up-up/down-down)，6对为反方向共表达（up-down/down-up）。类似地，共有15条Rinn LincRNA表达上调，18条LincRNA表达下调。随后进行的LincRNA-邻近编码基因共表达分析发现，共有9对共表达LincRNA-邻近编码编码基因，其中5对为同方向共表达(up-up/down-down)，4对为反方向共表达(up-down/down-up)。HOX cluster分析显示，2个编码转录本(HOXgene)上调，1个下调;2个非编码转录本（LncRNAs）上调，2个下调。实时荧光定量PCR法验证三个癌症信号通路中差异表达基因（CTNNB1、EGFR和PML）和两对共表达的LncRNA-邻近编码基因(RP11-165D7.4-RB1，AC013717.3-PPM1B) mRNA表达水平结果显示差异基因表达情况和芯片数据一致。 结论:HERC4基因高表达于乳腺癌细胞而低表达于癌旁乳腺细胞。在浸润性导管癌中，HERC4的表达与乳腺癌的临床病理参数相关—临床分期、组织学分级越高，HERC4表达量越高;发生淋巴结转移时，HERC4表达量升高。RNA干扰抑制乳腺癌细胞系MCF-7中HERC4表达后，细胞周期受到阻滞，细胞增殖受到抑制，提示HERC4可以作为乳腺癌基因治疗靶点进行研究。乳腺癌细胞MCF-7细胞下调HERC4表达后，其mRNA和LncRNA表达谱发生明显变化。差异表达基因涉及众多生理过程，差异表达LncRNA也具有众多调控功能，表明HERC4在多种层面上影响下游基因表达，具体分子机制有待进一步深入探讨。本研究为HERC4在乳腺癌发生过程中的分子机制研究提供信息。

目录

摘要

前言

第一章 HERC4在乳腺癌组织中的表达及临床意义

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

第二章 HERC4在乳腺癌细胞系中的表达

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 RNA干扰抑制HERC4表达对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖能力的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 RNA干扰抑制HERC4表达对人乳腺癌细胞系MCF-7的mRNA和LncRNA表达谱变化分析

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

结论

参考文献

成果

致谢

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