三尖瓣关闭不全致右心重构比格犬模型的生理学及分子学特征研究

摘要

三尖瓣关闭不全(tricuspid regurgitation，TR)是临床上最常见的瓣膜病变之一，通常是左心瓣膜病、肺动脉高压的合并病变。早期认为，左心瓣膜病变矫治以后，合并的TR会自行消退，后来的研究发现，左心瓣膜病变手术后TR并不会消退，而且有些会逐渐加重，严重影响病人的生存率和生活质量。左心瓣膜病变术后远期发生重度TR的病人预后差，其处理已成为瓣膜外科一个棘手的难题，因其手术指征、方法、时机和远期结果等方面存在着许多不确定性。一般认为，重度TR患者应该在发生不可逆的右心功能衰竭之前进行三尖瓣修复或置换，但如何区分可逆和不可逆的右心功能损害尚无客观标准。目前，主要是根据超声心动图、心脏核磁共振成像(CMR)、计算机断层扫描技术(CT)等检测手段以及病人的临床表现来对TR病人的心功能状态进行评估。 随着科技进步，各种不同的影像方法能用来显示右心室，其中就目前而言，超声心动图和心脏核磁共振(CMR)是用来评估右心室结构和功能最常用的两种影像技术，其中CMR被公认为是评估右心室功能的金标准，其它如多层CT扫描和核素显像在一些特殊病人上也是有价值的替代选择。用M型和2D超声来评估右心室受到其复杂形态和位置等的影响，虽然与心脏核磁共振获得的数据相比有良好的相关性，但却缺乏准确性和可重复性。超声心动图指南建议至少用其中一个超声心动图参数:1）右室心肌作功指数，即Tei指数，2）面积变化分数，3）组织多普勒血流流速峰值，4）三尖瓣环收缩期位移，来替代容积参数，从而实现定量评估评估右心功能。但其中无任何一个单一参数被证实适用于不同条件下评估右心功能，并且尚不能确定其对疾病预后和处理的影响。 目前，对右心重构的细胞和分子学机制研究较少，而且主要集中于对肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)致右心重构的研究，如神经内分泌信号，氧化应激，炎症，缺血，细胞死亡等会影响或加速右心重构和右心衰竭的进展，但其具体机制目前仍未阐述清楚。而且，右心重构研究的大部分数据来源于较完善的左心重构的机制研究，但左右心室心肌细胞在早期发育时就有所不同，左右心室的细胞信号和钙的调控也有所不同，提示左、右心室重构的机制可能有着根本的不同。 心肌重构是心脏功能从代偿发展为失代偿的关键病理改变，而心肌纤维化（myocardia fibrosis，MF）是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一。MF表现为成纤维相关细胞，特别是肌成纤维细胞，在受到刺激后（如心肌受损、氧化应激、炎症刺激、机械牵拉等）合成的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白的过度沉积。肌成纤维细胞通过产生多种生长因子、细胞因子、趋化因子、ECM蛋白及各种酶原等在纤维化过程中起着重要作用。其中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）是目前的研究热点，认为其改变在心肌重构过程中起着关键的作用。交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统在心肌重构中也起着非常重要的作用。 重度肺高压患者，为了克服肺高压，右心室心肌只能适应性地肥厚来增加收缩力。但紧接着心肌收缩功能就会逐渐减退，为了代偿性地维持射血量，右心室会储存更多血液，前负荷增加，导致右心室扩张，室壁张力增加，心肌氧耗增加，右心室灌注降低，进一步损害右心室收缩和舒张功能，形成一个恶性循环。而TR的发生主要是由于瓣环的扩张和右心室的扩大。首先，右心室压力、容量负荷的增加引起三尖瓣瓣环的扩张（第1阶段）。在这个阶段，三尖瓣返流出现与否决定于瓣环扩张和三尖瓣叶的对合程度。随着病情发展，右心室的不断扩大，由此引起的瓣环也不断变大，使得瓣叶对合不良，引起严重的TR（第2阶段）。最后，不断离心性增大的右心室（右心室重构）不仅引起瓣环的扩大，还束缚固定在右心室游离壁乳头肌上的三尖瓣腱索（第3阶段），加重返流量。重度TR患者进一步引起右心房、右心室扩张，形成恶性循环，右心会逐渐出现收缩、舒张功能减退，心排出量减少，因瓣环扩张和对合面积减少导致的三尖瓣关闭不全加重，最终导致失代偿性右心功能衰竭。这些病理改变与扩张性心肌病中功能性二尖瓣关闭不全十分相似，功能性TR可能可以视为专门累及右心室的扩张性心肌病。TR瓣环扩张，三尖瓣瓣叶的牵拉导致右心室重构和收缩功能降低[8]，使心脏结构、功能、代谢、冠状动脉灌注、神经激素激活以及分子信号等发生异常。 研究TR致右心重构的分子学机制有助于确定TR引起的右心重构和右心功能不全的诊断、预防和治疗的新策略。由于人体心肌组织标本难于获取，大多数学者是通过建立动物模型，造成右心功能不全或衰竭，对右心重构进行研究。因为右心室对压力负荷过度更敏感，成功建立压力负荷致右心室重构动物模型所花费的时间更短，所以大多数学者都是通过肺动脉高压建立右心重构模型。但这种模型并不能很好地反映TR右心容量负荷过大所造成的病理生理改变。通过折叠、切除、或介入的方法造成肺动脉瓣反流的研究方法，虽然是容量负荷增加的动物模型，但在建模的早期，三尖瓣的功能是正常的，右心房的病理变化过程并不能很好的表现出来，与TR导致右心重构的病理生理过程并不一致。因此，有必要建立TR的动物模型。有关TR引起右心容量负荷过度的动物模型报道很少，主要原因是建立这种动物模型在技术上具有一定的难度，成功建立右心重构动物模型所花费的时间长。 转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。目前尚未有文献研究容量负荷致右心重构的分子学和基因分析，TR致右心重构的具体机制尚不清楚，因此，本研究旨在通过建立比格犬重度TR的动物模型，进行长期动态观察，对其进行生理学和分子生物学的特性研究，特别是对其心脏组织的基因进行系统分析，通过转录组测序技术即RNA-seq技术，试图寻找TR致右心扩张或衰竭的生物标志物，以指导右心室功能的评估，手术时机的选择以及对预后的预测，寻找到预防、药物治疗TR所致的右心重构的靶标。 目的:建立一种新的三尖瓣关闭不全(TR)致右心重构的动物模型，长期饲养，对其进行生理学和分子学分析和研究。 方法：以比格犬为实验对象(n=14)，短时阻断上下腔静脉切开右房，心脏不停跳直视下剪除三尖瓣瓣叶，术毕行心脏超声检查，根据术中心脏超声TR与右房面积比(TR/RA)分为重度TR组（n=8，40％≤TR/RA＜70％）、极重度TR组(n=3，TR/RA≥70％)，假手术组为对照组(n=3，无TR)。在术前、术后3、6、12个月对比格犬进行称重和超声心动图检查，获取相关数据，动态观察TR对右心重构的影响。将饲养满14个月的2只动物处死并进行尸检，同时获取右心房、右心室、肝脏等器官组织标本，分别进行病理检查和RNA-seq基因测序分析。 结果：剪除三尖瓣前叶的比格犬8只，剪除前叶和后叶3只，术后即刻心脏超声检查TR面积与右房面积比(TR/RA)＞40％并且＜70％的有8只（重度TR组），TR/RA＞70％的3只（极重度TR组），假手术组3只，手术成功率100％。最长已饲养540余天，至今无一例自然死亡，存活率100％。手术组比格犬体重逐渐增加，部分动物出现腹水。超声心动图提示右房、右室增大，右心功能减退。处死的实验组比格犬解剖发现肝硬化及大量腹水，病理检查示右心房明显纤维化，比右心室明显，右心房、右心室心肌水肿、排列混乱，肝细胞水肿，提示发生右心重构和右心衰竭，基因检测示极重度TR会造成右心房明显分子重构，Ⅱ型胶原基因上调，并且核糖体蛋白合成减退，脂质生成代谢增加。假手术组比格犬与术前相比未见明显差异。 结论:采用直视下剪除三尖瓣瓣叶的方法可成功建立三尖瓣关闭不全致右心重构和右心功能不全的动物模型，具有操作简单、确实可靠、成功率高等特点，是研究右心重构的理想动物模型。极重度TR会造成明显的右心房结构重构和分子重构，其机制可能与细胞基质胶原增生，核糖体蛋白合成减退，脂质生成代谢增加有关。

目录

摘要

第一章 前言

一、三尖瓣关闭不全的发病率、危害及治疗

二、右心功能的影像学评估

三、右心重构的病理生理学机制

四、右心重构动物模型的建立

五、转录组测序分析技术在右心重构中的应用

第二章 材料和方法

一、主要的仪器、设备及相关试剂

二、实验设计和方法

第三章 结果

一、实验动物一般情况

二、实验动物的超声心动图检查

三、实验动物心脏及腹部病变

四、处死动物的病理学检查

五、RNA-seq检测结果

第四章 讨论

一、研究结果与分析

二、不足之处与展望

第五章 结论

参考文献

硕士在读期间发表和待发表论文及会议摘要

致谢

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