异基因造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血预处理方案的初步临床研究

摘要

研究背景与目的： 再生障碍性贫血（aplastic anaemia，AA）是骨髓造血功能衰竭性疾病。在1888年由Ehrich首先报道，后1904年由Chauffard提出再生障碍性贫血这一名称。本病特征表现为骨髓增生极度低下，外周血中有两项或三项符合以下标准:中性粒细胞＜0.5×109/L，血小板＜20×109/L，网织红细胞＜1％。重型再生障碍性贫血患者的治疗除防治出血、控制感染等支持治疗外，针对疾病本身的治疗很重要，目前以联合抗人胸腺细胞免疫球蛋白(anti-thymocyte immunoglobulin，ATG)和环孢素A(cyclosporin A，CSA)的免疫抑制治疗(immunosuppressivetherapy, IST)及异基因造血干细胞移植治疗为主。免疫抑制治疗是目前治疗重型再生障碍性贫血的有效方法。主要适用于输血依赖性的非重型再障;年龄大于40岁的SAA或极重型再障（very severe aplastic anemia，VSAA）;小于40岁的SAA或VSAA但无HLA全相合同胞供者。免疫抑制治疗起效时间一般在治疗后3-6个月内，但也有少部分患者延迟至1年才起效。再生障碍性贫血的免疫抑制治疗中单药的治疗反应率仅为30％～45％，而联合用药后其治疗有效率明显提高。抗胸腺细胞球蛋白/抗胸腺细胞球蛋白联合环孢素A是目前标准的治疗方案。采用该方案的有效率可达到50％～80％，5年生存率可达75％-85％。异基因造血干细胞移植是重型再生障碍性贫血的有效治疗手段之一。全相合同胞供者(matched sibling donor, MSD)造血干细胞移植已经成为年龄小于40岁SAA患者的一线治疗，长期生存率高达70-90％。目前重型再生障碍性贫血患者异基因造血干细胞移植时的主要预处理方案为以环磷酰胺为基础的含抗胸腺细胞球蛋白的预处理方案。近年文献报道采用该预处理方案行异基因造血干细胞移植的重型再生障碍性贫血患者的植入率为85％-95％，仍有5％-15％的患者面临植入失败和移植后供者造血干细胞被排斥，这也是近年临床研究发现长期困扰造血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血的问题之一。因此如何增加重型再生障碍性贫血患者异基因干细胞移植的植入和减少移植后排斥仍是目前值得探讨的问题。影响重型再生障碍性贫血患者造血干细胞长期植入的因素包括供受者之间未能成功的建立起免疫耐受、严重感染、急慢性移植物抗宿主病影响、植入细胞数不够、预处理强度及移植前免疫抑制治疗等。而研究表明重型再生障碍性贫血患者发生移植失败或排斥的经更强预处理的第二次造血干细胞移植可获得成功植入提示预处理免疫抑制的强度可能影响供者干细胞的持续植入。因此能否在以环磷酰胺为基础的预处理中进一步提高免疫抑制的强度以增加重型再生障碍性贫血患者allo-HSCT的植入和减少移植后的排斥？我们在环磷酰胺为基础的预处理中加入氟达拉滨以提高预处理的免疫抑制强度，并对22例重型再生障碍性贫血患者进行了异基因造血干细胞移植，观察该具有更强免疫抑制的FBCA预处理方案对重型再生障碍性贫血患者的供者造血干细胞的持续植入的影响，分析患者长期生存及移植并发症等情况。 方法： 研究对象:2000年1月到2011年6月在南方医科大学珠江医院血液科接受异基因骨髓联合外周血或单纯外周血造血干细胞移植的重型再生障碍性贫血患者22例。其中男性为12例，女性为10例，年龄5-52岁，中位年龄21岁。诊断至进行移植的时间为1～125个月，中位时间为5个月。14例为全相合同胞供者造血干细胞移植，8例为不全相合亲缘供者造血干细胞移植。22例中共12例在移植前接受包括环孢素在内的多种免疫抑制剂治疗，但均未接受ATG治疗。供受者血型相合12例，血型不合10例（主要不合2例，次要不合6例，主次均不合2例）。男供女7例，女供男8例，父母供子女4例。所入组病人在移植前均无心、肝、肾等重要器官功能障碍及严重的真菌、细菌感染。 供者的选择及HLA配型:再生障碍性患者的健康直系亲属作为供者选择人群。HLA配型检测采用直接核昔酸序列分(sequenceing-basedtyping，SBT)（高分辨分型或等位基因水平分型）的方法。HLA配型结果作为选择供者的主要评价标准，选择与患者HLA配型至少5/10相合的亲属作为供者。血型相合与否可不作为供者排除标准，但在HLA配型相合程度相同时可首选血型相合者作为供者。 预处理方案:所有患者均接受FBCA预处理方案，具体为氟达拉滨(fludarabine, Flu)30mg/m2/d×5d，白舒非(Busulfex, Bu)3mg/kg×2d(2000年至2004年间患者采用口服方式，2004年以后患者均使用静脉方式)，环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)60mg/kg/d×2d，抗胸腺细胞球蛋白（即复宁）2.5mg/kg/d×5d。 干细胞动员、采集及移植:供者接受干细胞集落刺激因子10μ g/(kg·d)连续皮下注射5～6天，于动员第4天，采集骨髓干细胞，第5天，应用血细胞分离机(CS3000 plus)采集干细胞1～2次，每次循环血量10～12L，过程中予枸橼酸钠抗凝。22例患者移植输入的中位有核细胞数为7.8(3.1～13.9)×108/kg（受者体重），中位CD34+细胞数为8.0(4.2～13.5)×106/kg。 移植物抗宿主病(graft-versus-host disease， GVHD)防治:术后移植物抗宿主病预防联合应用环孢素A、短程甲氨碟呤(MTX，+1d15mg/m2，+3d、+6d、+11d10mg/m2)，移植-1天开始予环孢素3～4mg/(kg·d)，使血药浓度维持在100-300 ng/ml。发生急性GVHD时，加用甲泼尼龙(1～2mg/kg·d)及其他免疫抑制剂治疗，部分病情严重者予输注骨髓间充质干细胞。 出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)的防治:预处理期间采用水化、碱化、美司钠解救、强迫利尿等方法预防出血性膀胱炎的发生。HC的治疗:碱化、水化、强迫尿液;根据HC的病因采用抗病毒、控制GVHD等处理;必要时血小板输注。 感染的预防:移植前予肛肠科、妇产科、口腔、眼科、耳鼻喉科会诊，清除隐匿的感染病灶。移植前口服肠道不吸收抗生素以清洁肠道，予更昔洛韦预防病毒感染。所有患者入住空气层流间全环境保护，工作人员及陪护人员做好消毒工作。移植后粒细胞缺乏时期予预防性使用抗生素。 植入状态观察:于移植后1月、3月、6月、12月、24月通过短串联重复序列多态性分析(STR-PCR)观察患者异基因干细胞植入、长期植入情况。 数据分析:分析22例患者移植后供者造血干细胞植入、长期植入情况，分析患者长期生存及移植并发症情况。 结果： 移植后患者均获得快速而持续的造血重建。22例患者中除3例因感染及移植物抗宿主病死亡外，19例患者均无病存活，中位存活时间为24个月(0.5月-140.5月)。 造血重建:移植输入的中位有核细胞数为7.8(3.1～13.9)×108/kg（受者体重），中位CD34+细胞数为8.0(4.2～13.5)×106/kg。。所有患者均获得快速而持续的造血重建，中性粒细胞达到0.5×109/L，血小板计数达到20×109/L的中位时间分别为15d(11～22d)和16d(12～27d)。 异基因造血干细胞移植后供者造血干细胞持续植入:在异基因造血干细胞移植后+30天、+90天、+180天、+360天、+720天分别对存活患者行DNA短串联重复序列多态性分析检测，除一例患者因重症肺部感染死亡于移植+15天、一例患者于移植+45天因Ⅲ度急性移植物抗宿主病死亡、一例患者于移植+150天死于重度巨细胞病毒肺炎外，移植后不同时间的STR-PCR结果均为完全供者嵌合体，无一例表现为混合嵌合体，表示供者造血干细胞的持续植入，无一例发生排斥。 移植相关并发症:(1)急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease，aGVHD):22例重型再生障碍性贫血患者移植后共有2例(9.1％)患者发生急性移植物抗宿主病，其中1例为Ⅰ度急性移植物抗宿主病，其具体表现仅为皮肤局部骚痒，无需糖皮质激素治疗;另一例为Ⅲ度急性移植物抗宿主病，其具体表现为严重腹泻、便血及肝功能严重损害，经过大剂量泼尼龙冲击、FK-506等治疗无效，于移植+45天死亡。(2)慢性移植物抗宿主病(chronic graftversus host disease，cGVHD):22例重型再生障碍性贫血患者中有3例(15.8％)患者发生慢性移植物抗宿主病，但症状均较轻微，仅表现为局限型。(3)巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染:入组的22例患者移植后共有10例出现全血巨细胞病毒滴度升高，其中9例为巨细胞病毒血症，使用更昔洛韦治疗2周后全部转阴，有1例于移植后出现巨细胞病毒性疾病，为重症巨细胞病毒性肺炎，经治疗无效死亡于移植+5月。(4)细菌及真菌感染:1例重型再生障碍性贫血患者于移植后出现重症肺部感染（真菌及细菌感染），经强效、广谱抗细菌及抗真菌治疗无效，死亡于移植+15天;22例重型再生障碍性贫血患者中有2例重型再生障碍性贫血患者移植后出现真菌及细菌败血症，1例表现为肠道感染，1例表现为口腔感染，均在积极抗感染治疗后得到控制。 生存情况:随访时间截止至2013年6月1日，随访1～141个月，中位随访时间24个月，19例重型再生障碍性贫血患者无病生存。22例重型再生障碍性贫血患者2年累计生存率为86.4％，死亡事件主要发生移植后半年，半年后进入平台期。 结论： 1、采用更强免疫抑制的FBCA预处理方案的异基因造血干细胞移植可使重型再障患者获得供者造血干细胞的稳定持续植入; 2、患者的移植相关并发症如急性、慢性移植物抗宿主病，感染，肝静脉闭塞综合征(hepatic vein occlusion disease，HVOD)，淋巴细胞增殖性疾病等并无明显增加。

目录

摘要

研究背景

1．再生障碍性贫血概述

2．再生障碍性贫血病因及发病机制

3．再生障碍性贫血诊断和分型

4．再生障碍性贫血的疗效评价

5．再生障碍性贫血的治疗

6．本研究的目的

一、研究对象

1．1 资料收集

1．2 纳入标准

1．3 排除标准

1．4 患者诊断标准

1．5 供者选择标准

1．6 病人特点

二、研究方法

2．1 患者移植前准备

2．2 干细胞动员、采集、移植

2．3 预处理方案

2．4 并发症及其防治

2．5 支持治疗

2．6 研究终点

2．7 统计学分析

三、疗效评估标准

3．1 造血重建

3．2 植入标志和造血嵌合体检测

3．3 移植相关并发症的诊断标准

四、结果

4．1 造血重建

4．2 异基因造血干细胞移植后供者造血干细胞持续植入

4．3 移植并发症

4．4 随访结果

五、讨论

5．1 增强预处理免疫抑制强度后有利于SAA患者的植入、长期植入率

5．2 增强预处理免疫抑制强度后并不增加SAA患者的并发症发生率

5．3 增强预处理免疫抑制强度后SAA患者的长期生存及生存质量情况

六、结论

参考文献

发表论文情况

致谢

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