脓毒症相关性脑病星形胶质细胞线粒体生物发生实验研究

摘要

研究背景： 脓毒症(sepsis)是指可能存在的或被证实的感染伴随全身性感染的表现，其本质是机体对病原体和免疫原性物质的免疫应答反应，是机体自身免疫性损伤的病理生理过程。脓毒症相关性脑病（sepsis associated encephalopathy，SAE）是一种弥散性脑功能障碍，由脓毒症所致的全身性炎症反应所引起，其特征是无中枢神经系统感染、脑解剖结构异常、脑出血或脑栓塞等临床或实验室依据，需排除肝性脑病、肾性脑病或肺性脑病等特异性脑部病变。SAE是脓毒症病程中最常见的脑功能障碍，发病率高达70％，可出现在脓毒症病程的任何时期，甚至先于脓毒症的临床症状而出现。SAE临床症状可表现为从轻度谵妄至重度昏迷等不同程度的脑功能紊乱。此外，由于脑功能的特殊性，SAE可通过影响自主神经系统和神经-内分泌系统的功能而影响其它重要器官的功能，加速多器官功能障碍综合征的发生和发展。目前SAE尚无公认的特效疗法或特效药物，治疗主要依赖于对脓毒症的早期、整体治疗以及对症和支持治疗。 虽然SAE发病机制复杂且尚未完全明确，但是有证据表明脑组织线粒体损伤是SAE的重要发病机制。线粒体是细胞进行生物氧化和能量转换的主要场所，通过氧化磷酸化以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的形式为细胞生命活动提供90％以上的能量，同时线粒体还是丙酮酸和脂肪酸氧化、尿素循环（鸟苷酸循环）等物质代谢的重要场所。此外，线粒体与细胞信号转导、细胞凋亡、钙离子代谢以及生成氧自由基等重要的生物活性分子密切相关。正常的线粒体功能对维持细胞存活及正常的细胞功能是必不可少的，线粒体功能障碍与细胞死亡以及许多人类疾病的发生有着密切的关系。由于脑组织几乎完全依赖从动脉循环中摄取的葡萄糖和氧在线粒体中代谢提供能量，因而线粒体功能障碍对脑组织的影响尤为突出。有学者发现脓毒症小鼠脑组织线粒体氧化磷酸化解偶联、膜电位下降、细胞色素丢失以及细胞色素C氧化酶活性显著下降，脑组织线粒体功能严重受损。还有学者对脓毒症大鼠脑组织进行观察发现，在海马、脉络膜等血脑屏障通透性较高的区域，神经细胞线粒体细胞色素C释放进入胞质增多导致神经细胞凋亡增加。综上所述，线粒体功能障碍与脓毒症脑组织细胞能量供应受损以及神经细胞凋亡增加密切相关，可加剧脓毒症脑功能障碍，被认为是SAE的主要发病机制之一。 线粒体生物发生受细胞核和线粒体生物发生相关调控因子的双重调控。线粒体生物发生是指已有线粒体的生长和分化，通过协调地表达、输入和装配细胞核和线粒体编码的线粒体蛋白以及调节线粒体的内容物和形态而实现。包括脑组织在内的线粒体生物发生均受细胞核和线粒体生物发生相关调控因子的双重调节，这些调控因子主要包括核呼吸因子-1和核呼吸因子-2(nuclear respiratoryfactor-1 and nuclear respiratory factor-2，NRF-1 and NRF-2)——调控核基因编码线粒体蛋白，线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）——启动线粒体DNA转录和复制，以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(peroxisomal proliferator-activated receptor gamma coactivator1 alpha,PGC-1α)——线粒体生物发生的主要调控因子，调控NRF-1、NRF-2和TFAM的表达。 线粒体生物发生在维持线粒体功能和数目以满足真核细胞生理需要方面具有重要作用。疾病状态下，若线粒体损伤后，线粒体生物发生增强则有助于维持线粒体功能和细胞能量状态，进而促进组织器官修复;反之，若线粒体生物发生受损与线粒体功能障碍同时出现，则可使线粒体功能进一步恶化，加重细胞、组织功能损伤。已有研究观察到线粒体生物发生受损和线粒体功能障碍同时存在于一些脑组织病变中:在阿尔茨默病、帕金森病等以线粒体功能障碍作为主要发病机制和显著特点的神经退行性病变中可同时观察到线粒体生物发生受损。然而，目前对脓毒症病程中脑组织线粒体生物发生受到怎样的影响尚无系统研究。 星形胶质细胞（astrocyte）并非仅仅是中枢神经系统中形态单一的营养支持细胞，而是一类具有丰富形态和复杂功能，并在中枢神经系统生理活动和病理过程中发挥十分复杂和重要作用的细胞。此外，本课题组在前期实验研究中发现脓毒症大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体结构和功能损伤具有可逆性。据此，本研究选用大鼠大脑皮质星形胶质细胞作为研究对象，通过建立脓毒症星形胶质细胞模型，研究在体外模拟的脓毒症环境中，星形胶质细胞线粒体在结构和功能方面的变化以及这种变化与星形胶质细胞线粒体生物发生之间的联系，并且提出假设:即在体外模拟的脓毒症环境中，大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生加强，有利于维持线粒体功能，促进线粒体损伤修复。 研究目的： 通过建立脓毒症星形胶质细胞模型，研究体外模拟的脓毒症环境中，大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体结构和功能的变化以及这种变化与星形胶质细胞线粒体生物发生之间的关系，同时观察星形胶质细胞线粒体融合和分裂活动的变化，为揭示SAE发病的分子机制提供实验参考。 研究方法： 1.组织块培养法培养原代Sprague-Dawley(SD)大鼠大脑皮质星形胶质细胞。 2.通过免疫细胞化学方法鉴定培养细胞中星形胶质细胞纯度:即采用星形胶质细胞特异性抗体——胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体和小胶质细胞特异性抗体——离子钙接头分子-1抗体(ionized calciumbinding adapter molecule1，iba-1)对培养细胞纯度进行免疫细胞化学鉴定。 3.建立脓毒症星形胶质细胞模型:根据文献报道，采用大肠杆菌细胞壁脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）50 ng/ml和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)200 U/ml与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育的方法建立脓毒症星形胶质细胞模型，在体外环境下模拟脓毒症对大鼠大脑皮质星形胶质细胞的影响。 4.验证脓毒症星形胶质细胞模型:通过检测脓毒症星形胶质细胞模型建立后0小时、3小时、6小时、12小时和24小时五个时点星形胶质细胞培养基中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、一氧化氮(nitric oxide，NO)和星形胶质细胞内活性氧族(reactive oxygen species，ROS)浓度，验证脓毒症星形胶质细胞模型的建立。 5.实验分组:根据干预因素(50 ng/ml LPS和200 U/ml IFN-γ)对大鼠大脑皮质星形胶质细胞作用时间的不同，本研究共分为4个实验组，即0小时组[正常对照组，予等体积10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)/低糖达尔伯克改良伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）替代50 ng/ml LPS工作液和200 U/ml IFN-γ工作液与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育]、6小时组（脓毒症组，50 ng/ml LPS工作液和200 U/ml IFN-γ工作液与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育6小时）、12小时组（脓毒症组，50 ng/ml LPS工作液和200U/ml IFN-γ工作液与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育12小时）和24小时组（脓毒症组，50 ng/ml LPS工作液和200 U/ml IFN-γ工作液与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育24小时）。 6.评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体结构和功能变化情况 6.1制作各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞超薄切片，通过透射电镜观察超薄切片中星形胶质细胞线粒体超微结构变化。 6.2各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体超微结构评分方法:大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体超微结构损伤共分为1至5五个等级，分别评分为0至4分:1级（0分）:正常超微结构线粒体;2级（1分）:早期轻度水肿线粒体，表现为线粒体嵴分离和基质密度减低;3级（2分）:线粒体水肿较2级更加明显，表现为线粒体嵴明显分离和基质密度明显减低;4级（3分）:线粒体广泛水肿并伴有结构破坏，但内外膜尚完整;5级（4分）:线粒体广泛水肿，结构破坏并伴随内外膜破裂。 6.3检测各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞内ATP浓度。 7.评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生相关调控因子表达情况 7.1采用实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)评估转录水平各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生相关调控因子（即PGC-1α、NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和TFAM）表达情况。 7.2采用蛋白质印迹法评估翻译水平（总蛋白）各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生相关调控因子（即PGC-1α、NRF-1、NRF-2α、NRF-2β和TFAM）表达情况。 7.3采用蛋白质印迹法评估翻译水平（核蛋白）各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞PGC-1α表达情况。 8.通过凝胶迁移电泳（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）实验检测各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞TFAM与线粒体DNA的结合能力，并通过超迁移分析实验(super-shift analysis)判断EMSA实验中目的迁移条带的位置。 9.采用RT-PCR方法评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体DNA相对含量。 10.通过“计点网格法”评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体体积密度。 11.采用蛋白质印迹法评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体DNA编码蛋白——线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(cytochrome C oxidase1，COX1)和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位2(cytochrome C oxidase2，COX2)表达情况。 12.采用蛋白质印迹法评估各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体融合与分裂活动调控蛋白——视神经萎缩1基因蛋白(optic atrophy1 gene protein，OPA1)和动力相关蛋白1（dynamin-related protein1，DRP1）表达情况。 13.统计方法:应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(mean± standard devition,(x)±s)表示，多组资料间均数比较采用方差分析，首先进行方差齐性检验，方差不齐时采用Welch检验结果。多组均数间两两比较:方差齐者用最小显著差值法（Least-significant Difference，LSD），方差不齐者用Dunnett' T3法。P＜0.05为差异具有统计学意义。 结果： 1.本研究采用组织块培养法培养的原代大鼠大脑皮质星形胶质细胞在所培养细胞中所占比例＞95％，小胶质细胞在所培养细胞中所占比例＜5％;即星形胶质细胞纯度＞95％，符合实验要求。 2.LPS和IFN-γ与大鼠大脑皮质星形胶质细胞共孵育3小时（186.79±40.28pg/ml;54.55±4.08 pg/ml）、6小时（872.93±82.47 pg/ml;49.55±3.72 pg/ml）、12小时（705.30±124.95 pg/ml;53.77±3.87 pg/ml）和24小时（810.93±73.43pg/ml;48.51±2.93 pg/ml

目录

摘要

前言

材料和方法

结果

1．培养的原代大鼠大脑皮质星形胶质细胞纯度鉴定结果

2．脓毒症生物标记物检测结果

3．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体超微结构电镜观察及评分结果

4．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞内ATP浓度测定结果

5．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生相关调控因子转录水平表达情况检测结果

6．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体生物发生相关调控因子翻译水平表达情况检测结果

7．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞TFAM-mtDNA结合能力检测结果

8．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体DNA相对含量检测结果

9．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体体积密度检测结果

10．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体DNA编码蛋白翻译水平(总蛋白)表达情况检测结果

11．各实验组大鼠大脑皮质星形胶质细胞线粒体融合和分裂活动调控蛋白翻译水平(总蛋白)表达情况检测结果

讨论

1．脓毒症星形胶质细胞模型的建立

2．线粒体生物发生调控

3．线粒体生物发生与脓毒症多器官功能障碍

4．线粒体生物发生触发因子

5．线粒体融合与分裂

6．进一步研究方向

7．研究的局限性

结论

本研究的特色与创新之处

参考文献

主要缩略词表

致谢

声明

统计学审稿证明