动态对比增强磁共振成像在胶质瘤病理分级及与CTGF、HIF--1α表达的相关性研究

摘要

背景与目的: 胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，其中高级别胶质瘤约占原发性恶性脑肿瘤的70％[1]，严重危害人类的生命健康。自1971年Folkman[2]提出肿瘤生长血管依赖性学说以来，大量研究表明肿瘤的血管生成是肿瘤发生、发展、局部浸润和转移的重要条件，且不同级别胶质瘤的微血管生成程度和微血管结构改变不同[3]。因此，对肿瘤微血管的评估有可能成为预测胶质瘤分级的良好指标。肿瘤血管生成受多种因子的调控。其中，血管内皮生长因子(vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF)的促血管生成作用已被大量研究证实[4-7]。从肿瘤微环境的角度来讲，胶质瘤的局部常常处于缺氧的状态。在缺氧早期，缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor1α，HIF-1α)表达升高，在肿瘤缺氧的适应过程中起了关键作用。HIF-1α的高表达可以促进靶基因VEGF转录，增强VEGF mRNA稳定性，实现其对肿瘤血管生成的调控[8]。CTGF可以直接调控HIF-1α，进而调控VEGF[9,10]，从而促进血管形成。且HIF-1α、CTGF的表达与胶质瘤的恶性程度相关[11-13]。因此，HIF-1α、CTGF有可能作为判断胶质瘤级别的重要指标，其表达情况有可能与反映肿瘤血管生成情况的磁共振灌注参数建立关系。 磁共振灌注成像技术是一种无创、定量的检查方法，其评估肿瘤血管生成的价值已得到广泛认可。新生的肿瘤血管通常发育不成熟，其血管内皮细胞间连接不紧密，血管基底膜不连续，从而导致血管通透性增加。基于T1WI的动态对比增强(Dynamic contrast-enhanced，DCE)磁共振成像所获得的灌注参数（Ktrans值、Ve值、Kep值）可以从不同的角度量化微血管的通透性，因此其对脑肿瘤的分级和鉴别诊断价值在近年来受到广泛重视。 本研究通过对39例不同级别的胶质瘤患者进行头颅DCE-MRI扫描，分析DCE-MRI灌注参数（Ktrans值、Ve值、Kep值）在不同级别胶质瘤的差异性，探讨其在胶质瘤术前分级的诊断价值。另一方面，本研究选取CTGF、HIF-1α作为靶点，定量分析这两个基因在32例胶质瘤样本中的表达情况。进一步分析DCE-MRI灌注参数（Ktrans值、Ve值、Kep值）与胶质瘤组织CTGF、HIF-1α表达的相关性，探讨利用DCE-MRI这一无创手段评估胶质瘤中这两个基因表达情况的价值。 材料与方法: (1)收集胶质瘤患者39例（男20例，女19例，年龄19～68岁，平均年龄42.41岁）。其中，低级别胶质瘤18例（Ⅰ级3例、Ⅱ级15例），高级别胶质瘤21例(Ⅲ级7例、Ⅳ级14例)。应用美国GE公司Signa EXCITE HD3.0T超导磁共振扫描仪对39例脑胶质瘤患者在术前进行常规MRI和DCE-MRI检查。DCE-MRI原始图像数据经Tofts-Kermode两腔室模型处理计算后获得Ktrans、Kep和Ve参数图。结合T1WI动态增强图像、Ktrans、Ve及Kep参数图，将感兴趣区(ROI)放置在肿瘤实质灌注最明显处，若肿瘤实质灌注不明显，则结合T2WI及T1WI图，放置在肿瘤实质中心区域，测得相应的Ktrans值、Kep值和Ve值。 (2)在术后，本研究收集了上述39例胶质瘤患者中的32例患者（男16例，女16例，年龄19～68岁，平均年龄41.81岁）的肿瘤标本[低级别胶质瘤17例(Ⅰ级3例、Ⅱ级14例)，高级别胶质瘤15例（Ⅲ级6例、Ⅳ级9例）]。同时，收集10例正常脑组织作为对照（正常脑组织来源于脑外伤或癫痫的成人患者因病情需要而切除的脑组织）。首先应用荧光定量RT-PCR、Western blot技术，分别检测了CTGF和HIF-1α在胶质瘤组织和正常脑组织中的mRNA水平和蛋白水平。进一步应用免疫组化检测胶质瘤组织和正常脑组织中CTGF和HIF-1α表达水平。免疫组化结果判断采用双盲法进行独立评估。显微镜下，随机选择10个高倍视野(×400)进行计数，每张切片根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数的多少进行分级。染色强度分为未着色、弱、中、强，分别积分为0、1、2、3;阳性细胞百分数分为0％、1％～25％、26％～50％、51％～100％，分别积分为0、1、2、3。并根据这两项指标分数之和分为四等级，0分者计为表达阴性(-)，1～2分者计为弱阳性(+)，3～4分者计为阳性(++)，5～6分者计为强阳性(+++)。此外，两项积分之和0～2分者为低表达，3～6分者为高表达。 (3)数据统计采用SPSS19.0及GraphPad Prism5.0统计软件包进行，检验水准a=0.05，以P＜0.05判定差异有统计学意义。计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示。高、低级别胶质瘤间Ktrans值、Ve值、Kep值的比较采用两独立样本t检验;Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤间Ktrans值、Ve值、Kep值的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，若有统计学意义，则需进一步做多重比较，当数据满足正态分布且方差齐性时，多重比较采用LSD法，否则，采用Dunnett's T3法;Ktrans值、Ve值、Kep值、胶质瘤级别之间的相关性分析采用Spearman相关分析;应用ROC曲线分析鉴别不同级别胶质瘤，获得Ktrans值、Ve值、Kep值在鉴别不同级别胶质瘤时的最佳诊断界点、敏感性和特异性。实时荧光定量RT-PCR各细胞样本的2-△△Ct值的比较采用One-Way ANOVA，如有统计学意义，则用Dunnett'T3法进行多重比较;两组间率的比较采用四格表x2检验。Ktrans值、Kep值及Ve值与CTGF、HIF-1α表达的相关性分析采用Spearman秩相关分析。 结果: 1.DCE-MRI灌注参数在胶质瘤术前分级评估的应用研究结果 1.1 Ktrans值、Kep值、Ve值在高级别胶质瘤与低级别胶质瘤组间的差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。 1.2 Ktrans值、Ve值在Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰ级与Ⅳ级、Ⅱ级与Ⅳ级、Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤组间的差异均有统计学意义（P值均＜0.05），而在Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。Kep值在Ⅰ级与Ⅱ级、Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅱ级与Ⅳ级胶质瘤组间的差异均有统计学意义（P值均＜0.05），而在Ⅰ级与Ⅲ级、Ⅰ级与Ⅳ级、Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤组间的差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。 1.3 Ktrans值、Ve值与胶质瘤病理分级呈正相关且相关关系密切（r=0.818，P＜0.001; r=0.757，P＜0.001）;Kep值与胶质瘤病理分级呈负相关性，但相关关系不密切(r=-0.376，P=0.018)。 1.4 Ktrans值与Ve值呈正相关(r=0.961，P＜0.001);Ktrans值与Kep值呈负相关(r=-0.552，P＜0.001);Ve值与Kep值呈负相关（r=-0.713，P＜0.001）。 1.5 Ktrans值、Ve值、Kep值在鉴别高级别与低级别胶质瘤时，ROC曲线下面积分别为0.907、0.898、0.780，Ktrans值、Ve值、Kep值用于判断高、低级别胶质瘤有显著意义（P＜0.001; P＜0.001; P=0.003）。Ktrans值的最佳诊断界点为0.054min-1，敏感性为95.2％，特异性为83.3％;Ve值的最佳诊断界点为0.051，敏感性为90.5％，特异性为88.9％; Kep值的最佳诊断界点为1.445min-1，敏感性为66.7％，特异性为90.5％。 1.6 Ktrans值、Ve值、Kep值在鉴别Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤时，ROC曲线下面积分别为0.929、0.910、0.838，Ktrans值、Ve值、Kep值用于判断Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤有显著意义（P＜0.001; P＜0.001; P=0.002）。Ktrans值的最佳诊断界点为0.092min-1，敏感性为100％，特异性为86.7％;Ve值的最佳诊断界点为0.054，敏感性为100％，特异性为86.7％; Kep值的最佳诊断界点为1.570min-1，敏感性为73.3％，特异性为92.9％。 1.7 Ktrans值、Ve值在鉴别Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤时，ROC曲线下面积分别为0.969、0.852，Ktrans值、Ve值用于判断Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤有显著意义(P=0.001;P=0.01)。Ktrans值的最佳诊断界点为0.119min-1，敏感性为85.7％，特异性为100％;Ve值的最佳诊断界点为0.116，敏感性为71.4％，特异性为85.7％。 2.胶质瘤病理分级与CTGF、HIF-1α表达的相关性研究结果 2.1 荧光定量RT-PCR检测结果显示，与正常脑组织相比，胶质瘤组织样本中CTGF、HIF-1α的mRNA水平上调，两者具有统计学差异(P＜0.001;P=0.002);而低级别胶质瘤与高级别胶质瘤相比，高级别胶质瘤中CTGF、HIF-1α的mRNA水平显著上调，两者具有统计学差异(P＜0.001; P＜0.001)。 2.2 Western blot检测结果显示，与正常脑组织相比，CTGF和HIF-1α蛋白在胶质瘤组织样本中的表达均上调。 2.3免疫组化检测结果显示，CTGF和HIF-1α蛋白在胶质瘤中的表达较正常脑组织明显上调。32例胶质瘤标本中，16例CTGF呈低表达，而16例呈高表达。而10例正常脑组织中，只有1例为CTGF高表达，其余9例均为低表达。CTGF在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异具有统计学意义(x2=5.060，P=0.031)。CTGF在胶质瘤组织中基本均为胞浆表达，未见胞核表达。32例胶质瘤标本中，17例HIF-1α呈低表达，而15例呈高表达。而10例正常脑组织中，只有1例为HIF-1α高表达，其余9例均为低表达。HIF-1α在胶质瘤组织和正常脑组织中的表达差异具有统计学意义(x2=4.393，P=0.036)。HIF-1α在胶质瘤组织中基本均为胞浆表达，亦可见部分胞核表达。 2.4 CTGF在高、低级别胶质瘤中的表达差异有统计学意义(P＜0.001)，而在患者性别(P=0.724)、年龄(P=0.433)中的差异均无统计学意义。HIF-1α在高、低级别胶质瘤中的表达差异有统计学意义(P＜0.001)，而在患者性别(P=1.000)、年龄（P=0.132）中的差异均无统计学意义。 2.5 CTGF表达与HIF-1α表达呈正相关且相关关系密切(r=0.760，P＜0.001);CTGF表达与病理分级呈正相关且相关关系密切(r=0.898，P＜0.001);HIF-1α表达与病理分级呈正相关且相关关系密切(r=0.810，P＜0.001)。 3.胶质瘤DCE-MRI灌注参数与CTGF、HIF-1α表达的相关性研究结果 3.1CTGF表达与Ktrans值、Ve值均呈正相关且相关关系密切(r=0.791，P＜0.001;r=0.743，P＜0.001);而与Kep值不存在直线相关关系(P=0.079)。 3.2 HIF-1α表达与Ktrans值、Ve值均呈正相关且相关关系密切（r=0.652，P＜0.001;r=0.626，P＜0.001）;而与Kep值呈负相关，但相关关系不密切(r=-0.357，P=0.045)。 结论: (1)随着胶质瘤病理级别的升高，Ktrans值、Ve值呈上升趋势，Kep值呈下降趋势。高级别胶质瘤的Ktrans值、Ve值显著高于低级别胶质瘤，而Kep值显著低于低级别胶质瘤。利用Ktrans值与Ve值判断胶质瘤病理级别，其敏感性和特异性均较高。尽管在鉴别诊断上Kep值的敏感性不如Ktrans值和Ve值

目录

摘要

前言

第一部分 DCE-MRI灌注参数在胶质瘤术前分级评估的应用研究

一、材料与方法

二、结果

第二部分 胶质瘤病理分级与CTGF、HIF-1α表达的相关性研究

一、材料与方法

二、结果

第三部分 胶质瘤DCE-MRI灌注参数与CTGF、HIF-1α表达的相关性研究

一、材料与方法

二、结果

第四部分 全文讨论

一、探讨DCE-MRI灌注参数术前评估胶质瘤病理分级的价值

二、CTGF、HIF-1α与胶质瘤病理分级的相关性研究

三、DCE-MRI灌注参数与CTGF、HIF-1α的相关性分析

第五部分 全文总结

参考文献

英文缩写词简表

学习期间发表的论文

致谢

声明