Lgr5通过VEGF介导的血管生成调节结直肠癌的转移

摘要

背景：结直肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一，然而在结直肠癌相关性死亡中，大部分为转移癌所致。近年来越来越多的研究聚焦于肿瘤转移，并不断探索肿瘤转移的机制，旨在减少肿瘤转移的发生，降低转移癌的死亡率。肿瘤血管生成是肿瘤生长以及肿瘤转移过程中非常重要的环节，VEGF是促进血管生成的重要因子，在肿瘤血管生成中也具有重要作用。目前有实验通过抑制VEGF的生成来抑制肿瘤血管形成，从而抑制肿瘤，但是对于结直肠癌的转移抑制作用不明显。因此，有必要进一步研究VEGF在结直肠癌形成以及转移过程中的机制。 近年来，研究发现Lgr5为小肠、结肠以及毛囊等组织的干细胞特异性分子标记物，并且在肝细胞癌、结肠癌、卵巢癌、基底细胞癌以及胃癌等实体肿瘤中高表达。Lgr5是Wnt信号通路的靶基因，并且可以反馈性地调节Wnt信号通路的活性，从而调控细胞的生长、运动和分化。越来越多的研究证实，Lgr5可能也为结直肠癌的肿瘤干细胞标记物，可以与其他肿瘤干细胞标记物一同用于结直肠癌肿瘤干细胞的筛选。根据“肿瘤干细胞学说”，有数据表明，结直肠癌可能来源于隐窝基底部Lgr5阳性的干细胞。这就证明Lgr5可能对于结直肠癌的发生发展具有重要作用。然而，目前关于Lgr5在肿瘤形成、发展以及转移过程中的作用及其机制的研究较少。我们课题组前期证实在结直肠癌细胞中敲低Lgr5的表达后可以抑制肿瘤的血管生成。 目的：为了避免单方面敲低Lgr5表达引起实验结果的偶然性以及进一步探讨Lgr5在结直肠癌及其转移癌中的作用，Lgr5对VEGF的影响及其机制，为以Lgr5为靶点的结直肠癌治疗提供理论依据。 方法： 1.构建Lgr5过表达质粒并建立稳定细胞株根据完整的人Lgr5(NM_003667)基因序列信息设计其编码区扩增引物，引物序列见表一，引物扩增总长度为2745bps。将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中，经检测序列正确。利用Lipofectamine2000将pcDNA3.1(+)-Lgr5质粒、pcDNA3.1(+)空载体质粒瞬时转染入SW480细胞，48小时后，以1000ug/mlG418进行连续筛选，约2-3周挑克隆并扩大培养，以600ug/mlG418继续维持。 2.Western blotting提取细胞的总蛋白，用BCA蛋白质定量试剂盒检测蛋白浓度，蛋白质样品上样量为20μg。电泳后将蛋白质电转至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，4℃孵育一抗过夜，一抗稀释比例为(Lgr51∶500，VEGF1∶200，GAPDH1∶1000，β-actin1∶1000)，次日二抗孵育1小时，ECL化学发光法显影。 3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)提取细胞、组织总RNA并测定RNA浓度，用M-MLV逆转录酶合成cDNA第一链，使用Takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行实时荧光定量PCR，引物序列见表一。 4.免疫组织化学（SP法） 收集南方医院结直肠原发癌标本58例，结直肠癌转移癌标本8例，组织经10％福尔马林固定，石蜡包埋，标本切成4μm薄片，65℃烤箱烤片约3小时，依次脱蜡水化，以0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)高温微波修复15min，利用迈新公司UltraSensitiveS-P超敏试剂盒，一抗4℃冰箱孵育过夜(Lgr51∶50、CD311∶50)，经DAB显色剂显色，苏木素复染，脱水透明，封片风干，显微镜下观察并拍片，两个病理科医生分别独立阅片并评分。 5.HE染色 组织经10％福尔马林固定，石蜡包埋，标本切成4μm薄片，65℃烤箱烤片约30分钟，依次脱蜡水化，苏木素染色2-5分钟，1％盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝15分钟，伊红染色数秒至数分钟，脱水透明，封片晾干，显微镜下观察并拍片。 6.Transwell小室迁移与侵袭实验将100ul浓度为以1×106/ml的细胞悬液加于上室，然后将500ul含10％FBS的培养基加于下室，培养24小时后，取出小室，4％多聚甲醛将细胞固定30分钟，结晶紫中染色10分钟，用棉签擦掉上室残留细胞，显微镜下随机选取5个视野进行细胞计数。侵袭实验在上室铺有一层基质胶，其余方法及操作均同迁移实验。 7.小管形成实验质粒瞬时转染后48小时收集培养基，经孔径为0.22μm的滤器分别过滤，收集为条件培养基。基质胶加入96孔板中，每孔加入50ul，37℃温度下交联1小时使胶固化。每孔加入50ul浓度为2×105/ml的HMVEC细胞，并且加入相应的条件培养基。于0h、2h、4h、8h在倒置显微镜下观察HMVEC细胞形成小管样结构的情况，并拍照，计数视野中小管样网状结构中的闭合环形小管结构的个数。 8.Elisa实验根据人血管内皮生长因子(VEGF) Elisa试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）的操作说明，检测重组细胞培养基中VEGF的浓度。 9.AOM/DSS模型的建立选取5-6周balb/c小鼠，随机分成2组，每组10只。实验组用终浓度为1.25mg/ml的AOM按照12.5mg/kg的剂量腹腔注射一次（10ul/g），对照组以腹腔注射等剂量生理盐水。对照组不做特殊处理，实验组进行如下处理:第1周正常饮水;第2周饮水含2.5％DSS，第3、4周连续2周正常饮水，此为一个循环;第5-10周，重复第2、3、4周处理2次，即总共三个循环。继续饲养至17周，处死老鼠并取结肠组织，观察其瘤体情况，将结肠以10％福尔马林固定，石蜡包埋，行HE染色。提取结肠组织RNA，并进一步行实时荧光定量PCR检测Lgr5以及VEGF的表达量。 10.裸鼠成瘤与肝转移实验裸鼠成瘤实验选取5-6周Balb/c裸鼠，随机分成2组，每组7只，饲养等级为SPF级。分别注射SW620 Lgr5 shRNA细胞、SW620 NC细胞至裸鼠背侧，调整细胞浓度为1×107/ml，注射200ul，注射细胞数为2×106个。观察裸鼠的成瘤情况，每隔3天称量裸鼠的体重，测量肿瘤的长径(L)以及宽径(W)，以公式L×W2/2计算出瘤体的体积。4周后，裸鼠安乐死，并取下瘤体，经10％福尔马林固定石蜡包埋，供后续HE染色。 裸鼠结直肠癌肝转移实验前期细胞准备与裸鼠同成瘤实验，以1％戊巴比妥钠6-8ul/g腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠左侧背部取长约1cm小口，暴露脾脏，沿着脾门上缘从脾脏头侧进针向脾脏尾部注射，将100ul浓度为1×107/ml的细胞缓慢注入脾被膜下，注射成功后，清理腹腔，逐层关腹并逐层缝合，并以纱布包扎。观察裸鼠的生长状态，每隔3天称量裸鼠的体重。3周后，处死裸鼠，并取下脾脏、肝脏、肺脏等组织，经10％福尔马林固定石蜡包埋，供后续HE染色。 结果： 1.免疫组化初步结果显示，在结直肠原发癌以及转移癌中，存在Lgr5表达越高，微血管密度(MVD)越高的趋势对结直肠原发癌、淋巴结转移癌、肝转移癌组织标本进行免疫组织化学染色，检测Lgr5以及血管内皮标记物CD31的表达，发现Lgr5的表达在淋巴结转移癌与肝转移癌中表达更高，并且CD31的表达同样也升高，即微血管密度升高。免疫组化初步结果显示，在结直肠原发癌以及转移癌中，存在Lgr5表达越高，微血管密度(MVD)越高的趋势，然而这种趋势以及二者的相关性还需要通过进一步加大样本量，获得统计学数据加以证明。 2.成功构建高表达Lgr5的稳定细胞株转染Lgr5重组过表达质粒pcDNA3.1(+)-Lgr5及pcDNA3.1(+)空载体质粒进入SW480并采用G418进行筛选，分别采用western blotting与实时荧光定量PCR技术检测Lgr5在SW480Lgr5与SW480vector中蛋白质以及mRNA的表达水平。结果发现，与SW480wector相比，Lgr5的蛋白质表达水平在SW480Lgr5细胞中明显升高;Lgr5的mRNA表达水平在SW480Lgr5细胞中同样明显升高(t=17.499，p＜0.05)。 3.Lgr5对肿瘤细胞迁移与侵袭能力的影响在迁移与侵袭实验中，与SW480vector细胞组相比，SW480Lgr5细胞组迁移与侵袭的细胞数明显增多（迁移:t=4.291，p＜0.05;侵袭:t=3.127，p＜0.05）;与SW620 NC细胞组相比，SW620 Lgr5 shRNA细胞组迁移与侵袭的细胞数明显减少（迁移:t=6.557，p＜0.01;侵袭:t=2.297，p＜0.05）。Transwell小室迁移与侵袭实验表明，升高Lgr5表达后肿瘤细胞的迁移与侵袭能力明显增强，敲除Lgr5表达后肿瘤细胞的迁移与侵袭能力明显减弱。 4.Lgr5对内皮细胞小管形成能力的影响用内皮细胞在Matrigel中形成闭合环形小管的数目表示内皮细胞小管形成的能力。与SW480vector组相比，8W480Lgr5组小管样结构明显增多(t=8.617，p＜0.05);与SW620 NC组相比，SW620 Lgr5 shRNA组小管样结构数明显减少(t=5.670，p＜0.05)。 5.Lgr5对结直肠癌细胞内血管内皮生长因子的影响通过Western blotting发现，与SW480vector细胞相比，SW480Lgr5细胞中VEGF的蛋白含量明显增多，与SW620 NC细胞相比，SW620 Lgr5 shRNA细胞VEGF的蛋白含量明显减少。通过Elisa发现，与SW480vector组相比，SW480Lgr5组中分泌VEGF的量明显增多(t=12.58，p＜0.01)，与SW620 NC组相比，SW620 Lgr5shRNA组分泌VEGF的蛋白含量明显减少(t=8.104，p＜0.01)。 6.AOM/DSS模型中，肿瘤组织Lgr5与VEGF的mRNA表达明显增高成功建立AOM/DSS模型，提取建模成功后的小鼠结肠组织RNA，行qRT-PCR显示，与对照组相比，实验组中Lgr5以及VEGF的mRNA的表达量明显升高（Lgr5: t=14.30，p＜0.01;VEGF:t=9.213，p＜0.01）。 7.敲低Lgr5的表达后，降低结直肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤以及肝转移能力在成瘤实验中，NC组的瘤体体积明显大于Lgr5shRNA组，并且这种显著差异在第3周开始体现出来。在裸鼠结肠癌肝转移实验中，与NC组相比，Lgr5shRNA组肝脏内癌结节数目明显较少(t=4.386，p＜0.05)。 结论：通过以上实验结果，我们可以得出以下结论: 1.在体外，Lgr5可以促进结直肠癌细胞的迁移与侵袭能力; 2.在体内，Lgr5可以促进结直肠癌的成瘤以及肝转移; 3.Lgr5可以促进内皮细胞的血管生成，可以促进结直肠癌中VEGF的表达; 我们通过功能性获得与失去实验、体内外实验，发现在结直肠癌中，Lgr5可能是通过促进VEGF的表达，从而促进血管生成，最终促进肿瘤形成与转移。因而我们的研究可以为以Lgr5为靶点的治疗策略提供理论依据。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料和方法

1．实验材料和试剂

2．实验仪器

3．实验方法

4．统计分析

第三章 结果

1．免疫组化初步结果显示，在结直肠原发癌以及转移癌中，存在Lgr5表达越高，微血管密度(MVD)越高的趋势

2．成功构建高表达Lgr5的稳定细胞株

3．Lgr5对肿瘤细胞迁移与侵袭能力的影响

4．Lgr5对内皮细胞小管形成能力的影响

5．Lgr5对结直肠癌细胞内血管内皮生长因子的影响

6．AOM／DSS模型中，肿瘤组织Lgr5与VEGF的mRNA表达明显增高

7．敲低Lgr5的表达后，可降低结直肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤以及肝转移能力

第四章 讨论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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