小剂量X射线诱导小鼠DNA甲基化谱改变的研究

摘要

研究背景： 随着核能在国民经济和军事领域中应用的扩展，电离辐射对人类的潜在危害也不断增加。与大剂量辐射事件或事故的发生相比，小剂量暴露虽不足以引起临床可观察到的急性放射性损伤，但若不及时采取有效的检测、危害评价和防护措施，将会给更多的人员造成远后效应形式的健康危害，并且可能因严重的心理损害而加重其他因素对健康的危害。因此，加强小剂量辐射(low doseradiation，LDR)对机体损伤的基础研究，对人类提高小剂量辐射对人体健康危害的认识及其防护具有重要意义。 LDR对人体产生的生物学效应复杂，随射线性质、剂量大小及受照个体的不同而有不同的表现形式，主要表现在以下四个方面:(1)适应性反应;(2)辐射超敏感性;(3)旁效应;(4)辐射诱导的基因组不稳定性(radiation-inducedgenomic instability，RIGI)。这些效应可以诱导多种系统急、慢性疾病及肿瘤的发生，同时还可以引起子女遗传性疾病和先天性畸形发病率的增高。其中RIGI表现为亲代辐射暴露细胞的子代细胞中存在着较高的细胞遗传学异常，这种改变具有遗传特性，包括DNA双链断裂、缺失突变率增高、基因表达改变、线粒体功能紊乱、细胞周期阻滞、细胞凋亡、微卫星不稳定等。大量研究表明，RIGI与表观遗传学密切相关。 DNA甲基化是最重要的一种表观遗传修饰方式。LDR引起的DNA甲基化具有剂量依赖性、性别差异性、组织特异性，具体表现在二方面:(1)辐射诱导全基因组DNA低甲基化;(2)辐射诱导抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化。前者可导致染色体不稳定性，后者使抑癌基因的转录失活，与胚胎发育和肿瘤疾病有着密切联系。Rad23b蛋白和XPC、中心体蛋白2共同组成了DNA损伤识别复合体，与DNA损伤的碱基或糖磷酸位点结合，参与了核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)信号通路;Ddit3基因编码的蛋白参与脂肪细胞和红细胞生成，通过内质网应激激活促进凋亡，充当抑癌基因的角色。在一些肿瘤中，两者均表现为高甲基化状态，被视为抑癌基因，然而两者在辐射引起的表观遗传学改变中尚未见报道。 目前，LDR所致DNA甲基化改变的相关研究多集中在基因组的整体甲基化水平，国内外仍缺乏LDR对机体生物学影响的具体方面及特定基因启动子区甲基化的系统性体内实验研究。因此，本实验构建不同的小剂量X射线辐射方式的BALB/c小鼠模型，在观察各组织标本全基因组甲基化水平外，利用高通量甲基化芯片技术建立全血甲基化差异谱，进一步鉴定及筛选代表性基因在各组织标本中启动子区CpG岛甲基化状态及mRNA表达水平。 目的: 通过构建LDR小鼠模型，应用高通量的甲基化芯片技术，基于甲基化谱的聚类分析初步描述LDR对机体靶器官的影响，及其涉及到的生物学过程。为小剂量辐射疾病的预防和早期诊断、疾病分型、预后判断和分子靶向药物的开发提供重要依据。 方法: 1.实验动物与分组:实验用SPF级BALB/c小鼠30只，雄性，4-6周龄（南京军区南京总医院比较医学中心），随机数字表法分为3组:对照组、0.5Gy单次照射组（急性照射组）和0.5Gy分次照射组（0.05Gy/d×10d，慢性照射组），每组10只。 2.照射方法及标本采集:X射线装置为瑞典医科达Precise型直线加速器，源皮距为100cm，剂量率为270cGy/min。分次照射组小鼠每天同一时间接受X射线0.05Gy全身照射，连续照射10天，第10天单次照射组小鼠接受0.5Gy全身照射。其中，分析小剂量射线早期效应的3组小鼠（每组按随机数字表法随机取5只，共15只），在末次照射后2h眼球摘除取血后处死，收集肾脏、肝脏、脾脏、脑及肺组织。分析远后效应的15只小鼠在末次照射后30d以同样方式采血、处死、收集各组织标本。 3.全基因组甲基化水平:各组血及组织DNA、RNA、蛋白提取;DNA水解，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测血液基因组整体甲基化水平;荧光实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和westenblot检测DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）、甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG binding domain protein2，MBD2) mRNA表达和蛋白水平。 4.甲基化谱的筛选及鉴定:通过Roche-NimbleGen小鼠甲基化DNA免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip，MeDIP-chip)，筛选三种不同照射方式的甲基化差异基因，进一步做基因分类(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG)信号通路分析;对8个代表性基因(Rad23b，Tdg，Ccnd1，Ddit3，Llgl1，Rasl11a，Tbx2，Slc6a15)进行MeDIP-qPCR验证;亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)和real-time RT-PCR比较照射前后Rad23b和Ddit3在不同组织标本中的甲基化和mRNA表达水平。 5.采用SPSS16.0软件进行统计分析，两组均数间比较用t检验，两组以上的组间比较采用单向方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.全血基因组甲基化水平改变:辐射后2h，分次照射组较对照组甲基化水平显著降低[(2.82±0.31)％vs(4.67±0.17)％，t=8.93，P＜0.05]，而单次照射组(4.43±0.13)与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。末次照射1个月后，单次照射组(4.61±0.11)％、分次照射组(4.42±0.12)％甲基化水平较对照组(4.67±0.17)％差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.DNMT1和MBD2在各组织中的mRNA和蛋白水平:与对照组比较，末次辐射后2h，分次照射组小鼠DNMT1 mRNA水平在血液、肾脏和肝脏中明显减少（P＜0.05），同时，MBD2 rnRNA表达在血液、肾脏、肝脏和脾脏中也降低（P＜0.05）;单次照射组DNMT1和MBD2 mRNA表达在各组织中差异均无统计学意义(P＞0.05)。然而，远后效应中，分次照射组小鼠仅MBD2mRNA表达在血液和脑组织中较对照组显著降低（P＜0.05），DNMT1 mRNA表达在肝脏组织中反而较对照组升高（P＜0.05）;单次照射组DNMT1和MBD2 mRNA表达在血液及各组织中较对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。western blot亦证实了这一结果（P＜0.05）。 3.在芯片结果中，根据对照组和单次照射组均未发生甲基化、分次照射组发生甲基化的条件，共筛选811个甲基化差异基因。进行GO和KEGG信号通路分析，发现这些差异基因几乎涉及所有的主要生物学过程，如大分子代谢、基因表达、发育过程、细胞增殖与分化等;信号通路如背腹轴形成、mTOR信号通路、NOD样受体信号通路等。 4.在811个差异基因中，根据Peak Score＞2，Peak M Value＞0.7，启动子类型为含CpG高的启动子(high CpG-containing promoter，HCP)或含中等量CpG的启动子(intermediate CpG-containing promoter，ICP)，基因类型涉及到损伤修复、细胞周期、凋亡、增殖等条件下，挑选8个代表性基因（Rad23b，Tdg,Ccnd1,Ddit3,Llgl1,Rasl11a,Tbx2,Slc6a15）进一步MeDIP-qPCR验证，结果与芯片一致(P＜0.05)，证实芯片结果的可靠性。 5.Rad23b和Ddit3在各组织标本中的甲基化和mRNA表达水平:与对照组和单次照射组比较，早期效应中，分次照射组Rad23b在血液、肝脏、脾、脑和肺组织的启动子均发生了高甲基化(P＜0.05); Ddit3在血液、肝脏和肺组织中启动子发生高甲基化(P＜0.05)。远后效应中，除了脾组织中的Rad23b和肺的Ddit3甲基化程度比2h降低外(P＜0.05)，其余仍保持高甲基化状态(P＜0.05)。Real-time RT-PCR检测Rad23b和Ddit3在各组织中的mRNA表达水平，结果提示基因启动子高甲基化的组织中均mRNA水平降低。 结论: 1.证实了小剂量X射线照射可引起小鼠全血基因组的低甲基化，且分次照射比单次照射更明显;全基因组的低甲基化可能与DNMT1和MBD2的表达下降有关。 2.首次系统性探讨了分次小剂量X射线照射可引起某些特定基因启动子区的高甲基化，这些差异基因几乎涉及到所有生物学过程，为进一步探索小剂量辐射相关效应的分子调控机制奠定理论基础。 3.在小剂量X射线小鼠模型中筛选出分次照射组诱导的一组敏感而特异的甲基化谱，为揭示其发病机制提供新的线索，有望为通过抑制机体DNA甲基化的方法及药物达到预防和治疗长期小剂量辐射引起的各种疾病提供重要依据。 4.辐射损伤相关基因Rad23b和细胞周期相关基因Ddit3的启动子持续性甲基化与低表达状态可能参与辐射诱导疾病的发生，为辐射诱导疾病的临床分子预测和防护药物开发提供理论依据。

目录

摘要

前言

第一章 实验材料

1．1 实验动物与分组

1．2 实验试剂

1．3 主要实验耗材和设备

第二章 实验方法

2．1 动物处理

2．2 血DNA提取

2．3 组织RNA提取

2．4 DNA水解

2．5 HPLC法

2．5．1 HPLC原理

2．5．2 HPLC检测步骤

2．6 Real-time RT-PCR

2．6．1 SYBR Green Ⅰ荧光染料技术原理

2．6．2 Real-time RT-PCR反应

2．7 Western Blot检测全血和组织中DNMT1、MBD2蛋白表达水平

2．7．1 试剂配制

2．7．2 提取组织总蛋白

2．7．3 SDS-PAGE电泳

2．7．4 半干式转膜

2．7．5 免疫印迹

2．7．6 化学发光，显影及定影

2．7．7 图片扫描和定量分析

2．8 小鼠甲基化芯片分析

2．8．1 具体方法

2．9 MeDIP-qPCR验证目的基因

2．9．1 MeDIP-qPCR基本原理

2．9．2 基本步骤

2．10 BSP检测Rad23b、Ddit3的甲基化水平

2．10．1 BSP基本原理

2．10．2 亚硫酸氢盐修饰

2．10．3 PCR反应

2．10．4 PCR产物纯化回收

2．10．5 连接反应

2．10．6 LB培养基配制

2．10．7 转化

2．10．8 挑选克隆

2．10．9 测序

2．11 统计学方法

第三章 实验结果

3．1 全血基因组DNA甲基化水平

3．1．1 HPLC检测全血基因组DNA甲基化水平

3．1．2 DNMT和MBD2 mRNA在各组织中表达

3．1．3 DNMT和MBD2蛋白在各组织中表达

3．2 MeDIP-chip芯片结果及鉴定

3．2．1 甲基化芯片结果

3．2．2 MeDIP-qPCR验证8个目的基因的甲基化水平

3．2．3 Rad23b和Ddit3在芯片中的位置和CpG岛预测

3．3 Rad23b和Ddit3在各个组织中的甲基化状态和mRNA表达水平

第四章 讨论

结论与展望

参考文献

缩略词表

综述 低剂量辐射诱导的基因组不稳定性与DNA甲基化之间的关系

攻读硕士期间发表的论文

致谢

声明