线粒体钙单向转运体在铅诱导的神经元氧化应激中的作用

摘要

背景: 目前铅中毒仍是公共卫生学方面的难题之一，环境中铅暴露对人体健康产生重大威胁。铅是一种对全身组织有广泛亲和力的毒物，不仅对人体大脑、心脏、肾脏和肝脏有严重毒性[1-3]，且铅对健康危害最强的是神经毒性，导致神经功能紊乱，表现为铅毒性脑病、周围神经病变、听力障碍和认知缺陷等。铅作为中枢神经系统的毒物，对神经功能产生不可逆的毒性作用，尤其对正在发育的儿童神经系统[4]。最近很多流行病学研究指出，妊娠期低浓度铅暴露可导致儿童认知功能损伤和行为功能缺陷[5-7]。同时有文献表明在动物和人群中，铅暴露可诱导发育中的中枢神经系统发生损害作用，表现为认知功能损伤、生长发育迟缓、多动症和神经化学物质亏损等[8]。因此研究铅神经毒性的意义非常重大。目前铅神经毒性机制主要包括铅与钙离子的竞争作用、铅致细胞凋亡以及铅对神经元的脂质过氧化损伤等。而产生铅神经毒性的具体机制尚未清楚，但是有很多文献报道铅诱导的氧化应激是铅神经毒性的机制之一[9，10]。研究表明低浓度铅可通过损伤细胞膜、DNA和抗氧化防御系统来诱导细胞发生氧化应激[1]。由于神经系统富含可被氧化的脂质，因此对铅诱导的氧化损伤尤其敏感。钙离子是细胞信号转导过程中不可缺少的离子，具有多种重要的细胞功能。有文献指出铅诱导的神经毒性可能与铅引起的钙离子紊乱有关，这可能是因为铅可扰乱钙离子的运输过程[11]。据此研究铅神经毒性机制是一个具有深远意义的课题，阐明铅致神经元细胞氧化应激机制对于明确铅神经毒性以及调节相关的病理生理过程都有重要的意义，并为迸一步明确相关疾病的发病机制和发现新的分子治疗靶点提供基础实验依据。 线粒体在维持细胞内离子平衡、能量代谢以及对外界因素的应激方面发挥着重要的作用。而且线粒体是产生活性氧自由基的主要场所，过多的活性氧自由基(reactiveoxidespecies，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的产生是发生氧化应激的必要条件[12]。有文献报道铅可诱导活性氧自由基的产生对机体造成氧化损伤[13]，而且通过降低质膜对活性氧自由基的防御能力和削弱细胞的抗氧化系统防御能力而间接导致氧化应激，比如消耗细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、抑制超氧化物歧化酶的活性和改变质膜的完整性等[14]。线粒体钙单向转运体(mitochonddrialcalcium uniporter，MCU)位于线粒体内膜，是介导钙离子从线粒体外进入线粒体基质的重要途径，参与调节线粒体内外钙的动态平衡，与细胞能量代谢和存活状态有密切联系[15]。有文献指出ROS调节着整个钙信号网络，同时细胞内的钙稳态也调节着ROS的产生[16]。钙离子作为第二信使，在细胞的生理病理功能中发挥着不可替代的作用，而且有报道称氟化物诱导的细胞内钙离子释放导致活性氧自由基的活化，从而发挥其细胞毒性作用[17]。而铅离子的转运机制与钙离子的转运机制相似，这有助于铅离子进入细胞内并易于在细胞内分布，因此铅可与某些钙结合蛋白结合而产生细胞毒性。MCU是选择性钙离子通道，对细胞内钙稳态发挥着重要作用。据文献报道，铅是钙离子的竞争性拮抗剂，而且铅可通过阻碍外钙浓度增加来抑制alpha7乙酰胆碱受体的活性而发挥铅神经毒性作用[18]。因此，尽管目前对铅神经毒性机制的研究在各方面都取得了巨大成果，但是线粒体钙单向转运体是否在铅诱导的神经元氧化应激这一过程起作用尚不清楚，而且铅是否通过线粒体钙单向转运体来干扰线粒体内钙平衡，从而打破细胞内钙稳态来发挥铅的神经毒性作用，目前尚未见报道。 目的: 本研究旨在探讨低浓度铅对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞、新生大鼠海马原代神经元和仔鼠海马氧化应激的影响，观察MCU蛋白表达和线粒体内钙离子变化，进一步研究铅神经毒性的分子机制。 方法: 1.取处在对数生长期的SH-SY5Y细胞，分别设对照组、2μM、10μM、50μM醋酸铅处理组在5％CO2、37℃孵育48h后，显微镜下观察细胞形态学改变和MTT实验检测细胞活力。 2.用不同浓度铅(0μM、2μM、10μM、50μM)处理SH-SY5Y细胞48h后收获细胞并检测细胞内ROS和GSH的含量变化。 3.用ROS荧光探针DCFH-DA孵育细胞后，在激光共聚焦显微镜下记录不同铅处理组的ROS荧光强度变化。 4.用不同浓度铅(0μM、2μM、10μM、50μM)处理SH-SY5Y细胞48h后收获细胞并用western blot实验方法检测MCU和nNOS蛋白表达变化。 5.用0μM、10μM铅处理SH-SY5Y细胞48h，再用MCU的激动剂精胺和抑制剂Ru360、MCU过表达质粒和干扰片段转染处理后检测细胞内的氧化应激情况。 6.用0μM和10μM铅处理SH-SY5Y细胞处理48h再加MCU的激动剂（spermine）和抑制剂(Ru360)、MCU过表达质粒和干扰片段转染处理后再用线粒体钙指示剂Rhod-2孵育细胞后，加入2mM外钙，在激光共聚焦显微镜下实时记录不同铅处理组的线粒体内钙离子变化。 7.取新生乳鼠海马神经元原代培养5天，用MAP-2抗体检测新生乳鼠海马神经元纯度，分别设对照组、2μM、10μM、50μM醋酸铅处理组在5％CO2、37℃孵育24h后，显微镜下观察神经元突起生长情况和MTT实验检测神经元细胞活力 8.用不同浓度铅(0μM、2μM、10μM、50μM)处理原代培养海马神经元24h后收获细胞并检测细胞内ROS和GSH的含量变化。 9.用0μM、10μM铅处理原代海马神经元24h后收获细胞提取神经元全蛋白并检测MCU蛋白表达变化。 10.用0μM、10μM铅处理原代培养海马神经元24h，再用MCU的激动剂精胺和抑制剂Ru360处理后检测细胞内的氧化应激情况。 11.取新生仔鼠哺乳期染铅21天后收获仔鼠海马组织，提取动物组织蛋白做western blot实验，分别检测动物海马组织中MCU和nNOS蛋白表达变化。 12.实验数据采用SPSS13.0进行统计分析，实验结果以(mean±SD)表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析(one-way ANOVA)分析。进行多组间的两两比较时先采用Homogeneity-of-variance test检测方差齐性，若方差齐性(P＞0.05)则采用LSD法，若方差不齐(P＜0.05)则采用Dunnett'T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.不同浓度的Pb2+(0μM、2μM、10μM、50μM)处理SH-SY5Y细胞48h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，与control组相比，随着铅浓度的升高，细胞数目逐渐变少，细胞突起变短，体积变小，胞质浓缩。随着铅浓度的升高，细胞活力逐渐减低，在铅浓度10μM组和50μM组分别下降了25.5％和47.0％，且差异有统计学意义(P＜0.05)。 2.随着铅浓度的升高，ROS含量逐渐增多，在铅浓度10μM和50μM组分别增多了6.1％和17.3％，，而GSH含量分别减少了10.4％和35.6％，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。 3.SH-SY5Y细胞ROS荧光强度发现随着铅浓度升高，ROS荧光强度不断增强。 4.随着铅浓度不断升高，nNOS蛋白表达显著性增多而MCU蛋白表达则显著性减少(P＜0.05)。 5.与control组相比，铅单独处理中的ROS显著性升高而GSH则显著性下降，MCU激动剂精胺以及MCU过表达的铅处理组较铅单独处理组出现GSH显著性升高、ROS显著性降低(P＜0.05)，MCU抑制剂Ru360以及MCU干扰的铅处理组则出现相反的表现。 6.与control组相比，铅单独处理组在加入2mM外钙时线粒体内钙离子显著性增高，而MCU激动剂精胺以及MCU过表达的铅处理组较铅单独处理组出现线粒体内钙离子显著性升高(P＜0.05)，MCU抑制剂Ru360以及MCU干扰的铅处理组则出现相反的表现。 7.原代海马神经元纯度达90％以上，培养的海马神经元可做后续实验。原代培养海马神经元经10μM铅处理24h后神经元突起数目较对照组减少，MTT法检测神经元细胞活力发现随着铅浓度的升高，神经元细胞活力不断下降。 8.与control组相比，ROS含量随着铅浓度升高而显著性增多，GSH含量则出现显著性降低(P＜0.05)。 9.原代培养海马神经元经10μM铅处理24h后MCU蛋白表达减少，且有统计学意义(P＜0.05) 10.与control组相比，原代海马神经元的铅单独处理ROS显著性升高而GSH则显著性下降，而MCU激动剂精胺的铅处理组较铅单独处理组出现GSH显著性升高、ROS显著性降低(P＜0.05)，MCU抑制剂Ru360的铅处理组则出现相反的表现，与在SH-SY5Y细胞中的结果一致。 11.在动物实验中，哺乳期染铅组与对照组相比，仔鼠海马神经元的MCU蛋白表达出现显著性降低，而nNOS蛋白表达显著性升高(P＜0.05) 结论: 本研究的实验结果显示，铅可诱导人SH-SY5Y细胞、新生大鼠海马原代神经元和哺乳期染铅仔鼠海马发生氧化应激，MCU参与了这一铅诱导的氧化应激的过程，线粒体内钙离子变化在其中起重要作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

结果

1．铅诱导人SH-SY5Y细胞发生氧化应激

2．铅处理SH-SY5Y细胞抑制MCU蛋白表达

3．MCU激动或抑制在铅致SH-SY5Y细胞氧化应激的作用

4．MCU过表达在铅致SH-SY5Y细胞氧化应激的作用

5．MCU干扰在铅致SH-SY5Y细胞氧化应激的作用

6．MCU在铅致SH-SY5Y细胞氧化应激中线粒体Ca2+和Pb2+的变化

7．铅诱导大鼠海马原代神经元发生氧化应激

8．MCU在铅致大鼠海马原代神经元氧化应激中的作用

9．MCU在染铅孕鼠仔代海马神经元氧化应激中的作用

讨论

小结

参考文献

硕士期间主要成果

致谢

声明