早期肠内营养对重度急性胰腺炎大鼠TNF--α、IL--6和IL--10表达水平的影响

摘要

背景目的:重度急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化系统疾病中需要紧急住院的疾病之一。SAP病情进展快，死亡率高达36％-50％。SAP的发病机制复杂，其发病过程总体上是一种炎症发生发展的过程。主要机制是由于提前激活的胰酶进入并损伤胰腺和胰周组织，激活TNF-α、 IL-1β、IL-6等促炎细胞因子和血小板活化因子等炎症介质，进而介导局部和全身的细胞因子瀑式反应。这种细胞因子网络级联瀑式反应，常常难以阻挡，继续进展恶化形成全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）导致SAP患者出现单个或多个器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，这是SAP患者早期死亡的主要原因。而SIRS发生后可能伴随着抗炎因子如IL-10、IL-2的产生，限制促炎细胞因子的过度表达，起到保护机体的作用。但是过度代偿的IL-10等抗炎细胞因子亦可形成代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)，导致机体免疫功能下降，诱发感染或败血症，最终导致MODS。因此，若TNF-α、 IL-6等促炎细胞因子占优势则发生SIRS，表现为细胞凋亡、休克甚至MODS，若IL-10、IL-2等抗炎细胞因子过度表达则CARS占优势，表现为免疫抑制，出现感染，亦加重MODS。此外，细胞因子失衡还可以出现混合型拮抗反应综合征(mixedantagenists response syndrome，MARS)。所以SIRS与CARS的平衡决定着SAP的发展方向。 SAP发病机制非常复杂，目前还未能完全阐明其具体的发病机制。因此针对SAP的治疗方案主要是对症治疗为主，其中营养支持对治疗SAP的重要作用逐渐被人们所重视。目前SAP的营养支持手段主要有肠内营养(enteralnutrition，EN)和肠外营养(parenteral nutrition，PN)两种方式。以往认为胰腺需要“休息”，因此通过EN刺激胰腺分泌的行为被认为是有害的。然而近年来随着对SAP研究的深入，大量研究显示PN易产生肠道细菌移位(bacterialtranslocation，BT)，加重SIRS，在死亡率、MODS、感染性并发症发生率、住院天数方面显著高于EN。相反地，EN可以通过改善机体免疫功能，调节促炎和抗炎细胞因子间平衡、保护肠道屏障，减少BT等途径减轻SIRS及MODS的发生，促进预后。2013年美国胰腺病协会和国际胰腺病协会联合发表的急性胰腺炎治疗指南中把EN作为营养支持的首选，同时把PN放入二线治疗，仅当患者通过EN无法达到营养支持目的时候使用。因此SAP患者固有的禁食和PN的传统治疗观念正逐步向EN治疗观念转变。 近年来众多临床研究发现，在SAP早期即给予EN能够改善SAP患者病情，促进预后:Sun等研究发现，入院后48h内给予EN能显著降低SAP发病早期过度活跃的免疫反应，同时并不引起免疫抑制，并且早期肠内营养(early enteralnutrition，EEN)还可以防止腹腔内高压（intra-abdominal hypertension，IAH）的发生和发展，总体上能改善临床疗效;Marik PE建议SAP患者入院24h内即应给予EN从而有效改善患者预后。Petrov MS等对11组随机对照试验进行分析发现:入院48h内实施EN，与PN相比，急性胰腺炎(aucte pancreatitis，AP)的死亡率、MODS和胰腺感染性并发症的发生率显著降低，而入院48h以后实施EN或PN的效果相似;Spanier BW等的研究发现EN对AP的结局产生有利影响，并建议在48h内尽快实施。Li等研究发现入院后48h给予EN能通过降低并发症的发生率而显著改善AP的临床预后。在其他研究EN的文献当中也发现，EEN能改善相关疾病的预后:Heyland DK提出与入院48h后给予EN相比，危重病人入院48h内给予EN能使感染性并发症的发生率和病人死亡率分别减少24％和32％。Mclave SA也提出对早期入住ICU的危重病人给予EN能下调SIRS，减少过度氧化应激，以提高患者预后。因此，2012年的国际胰腺炎治疗的国际共识指南建议尽可能早的使用EN。 目前临床上关于EEN实施时机的研究颇多，但需要指出的是绝大多数这类文章是以患者入院后作为研究的起始时机，而不是以起病后作为起始时机，这样并不能精确地反映EEN的优劣。同时，临床上病情的复杂性、治疗的安全性、病人的依从性、患者入院时间的不可控性等都是限制临床研究的客观因素，而利用动物实验可以满意地解决上述问题。 因此，本研究拟通过制备SAP大鼠模型，于起病后12h给予EEN，以典型的炎症细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10)作为观察指标，观察不同治疗阶段的EEN（营养支持后第12、24、48h）对SAP大鼠血清及胰腺组织TNF-α、IL-6、IL-10表达水平的影响，从而对SIRS的发生发展及SAP病程演变进行初步评估，判断EEN治疗的有效性和安全性，为进一步临床研究提供依据。全文研究内容分为2个部分: 第一部分重度急性胰腺炎动物模型的建立 方法: 1.12只健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组（6只）和SAP模型组（6只）。SAP模型组大鼠采用逆行胆胰管注射法，诱导剂为5％牛磺胆酸钠(0.1mL/100g)。假手术组大鼠开腹后翻动胰腺5次后关闭腹部。 2.2组大鼠进行血清淀粉酶测定，同时结合胰腺病理学改变和胰腺病理评分来判定SAP模型的制作成功。 3.统计方法数据采用SPSS16.0软件进行统计学检测，血清淀粉酶和胰腺病理评分采用独立样本T检验方法进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.SAP模型组大鼠逆行胆胰管注射5％牛黄胆酸钠后，血清淀粉酶含量明显上升，与假手术组相比有统计学差异(P＜0.05)。 2.胰腺病理学改变:假手术组大鼠胰腺组织学形态正常。SAP模型组大鼠胰腺组织可见水肿、出血、灶状坏死及炎症细胞浸润。 3.胰腺病理评分结果显示:SAP模型组大鼠的胰腺病理评分明显增加，与假手术组相比有统计学差异(P＜0.05)。 结论: SAP大鼠模型制备成功，适用于SAP肠内外营养治疗效果的研究。 第二部分早期肠内营养对重度急性胰腺炎大鼠TNF-α、IL-6和IL-10表达水平的影响 方法: 1.48只健康雄性SD大鼠，随机分为8组:假手术组（6只）、SAP模型组(6只)、PN组分为12h组、24h组、48h组（每组各6只），EN组分为12h组、24h组、48h组（每组各6只）。 2.假手术组大鼠开腹后翻动胰腺5次后关闭腹部。SAP模型组大鼠采用逆行胆胰管注射法，诱导剂为5％牛磺胆酸钠(0.1 mL/100g)，见胰腺组织充血、水肿，被膜下有散在出血点时，提示造模成功，关闭腹部。EN组和PN组大鼠术中见造模成功后再分别给予胃造瘘空肠置管和留置针尾静脉穿刺后均连接于微量输液泵，并于造模后12h通过微量泵分别给予肠内外营养液。 3.假手术组和SAP模型组大鼠在术后留观确定成活后处死，而EN组和PN组大鼠分别在营养支持后12h、24h、48h后分批处死。所有大鼠处死前均行心脏采血，分别使用全自动生化分析仪和ELISA试剂盒检测血清淀粉酶和TNF-α、IL-6、IL-10含量。取胰腺组织，一部分以10％中性甲醛溶液固定、石蜡包埋，切片后行组织病理学HE染色，病理切片采用胰腺病理评分法进行评估，余下的胰腺组织采用RT-PCR的方法检测TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表达。取空肠组织制作病理切片后观察空肠粘膜损伤情况并使用显微镜测微尺测量空肠粘膜厚度和绒毛高度。 4.统计方法:所有实验数据统计分析均采用SPSS16.0统计学软件，数据以均数±标准差((x)±s)表示。EN和PN治疗效果的总体比较和不同时段间的总体比较采用2×2两因素析因设计资料的方差分析（factorial design ANOVA）;同时间点EN组和PN组的组间比较采用独立样本T检验方法;EN组和PN组各自亚组间多重比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)中的最小显著差异（least significantdifference，LSD）t检验;所有比较结果以P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1.血清淀粉酶含量:总体水平上EN组和PN组在降低血清淀粉酶含量方面未有明显差异(P＞0.05);不同时段间整体比较，结果亦未有统计学差异(P＞0.05);同时间点EN组和PN组比较，血清淀粉酶含量未有明显差异(P＞0.05);EN组和PN组各自亚组间比较，血清淀粉酶含量亦未有统计学差异(P＞0.05)。 2.血清TNF-α含量:整体水平上，EN组在降低血清TNF-α水平方面优于PN组;不同时段间整体比较，12h段血清TNF-α水平明显高于24h段和48h段(P＜0.05)，而后二者未有明显差别(P＞0.05);在同时间点EN组和PN组比较中，EN12h组血清TNF-α含量较PN12h组明显降低(P＜0.05)，而24h、48h组间比较未见显著性差异(P＞0.05);在EN组和PN组各自亚组间比较中，EN组和PN组的12h组均明显高于各自的24h和48h组(P＜0.05)，而24h和48h组间差异未有统计学意义(P＞0.05)。 3.血清IL-6含量:总体水平上，EN组在降低血清IL-6水平方面优于PN组;不同时段间整体比较均有明显差异(P＜0.05)，其中12h段血清IL-6水平最低，48h段最高;EN组血清IL-6水平均较同时间点PN组降低，差异有显著性(P＜0.05); EN组和PN组各自亚组间比较亦均有差异(P＜0.05)，其中EN组和PN组的48h组大鼠血清IL-6水平最高，12h组最低。 4.血清IL-10含量:EN组在提高血清IL-10水平方面优于PN组;不同时段间整体比较均有明显差异(P＜0.05)，其中12h段血清IL-10水平最低，48h段最高;EN组血清IL-10水平均较同时间点PN组上升，差异有显著性(P＜0.05);EN组和PN组各自亚组间比较亦均有差异(P＜0.05)，其中EN组和PN组的48h组大鼠血清IL-10水平最高，12h组最低。 5.胰腺组织中TNF-α、IL-6、IL-10mRNA表达水平:电泳结果显示，总体水平上，EN组在降低TNF-α、IL-6mRNA表达和增加IL-10mRNA表达方面优于PN组(P＜0.05);不同时段间整体比较，在TNF-α mRNA中，12h段最高(P＜0.05)，24h和48h段无明显差异(P＞0.05);在IL-6mRNA中，12段最低，48h段最高(P＜0.05);在IL-10mRNA中，24h段最高，12段最低(P＜0.05);同时间点EN12h组TNF-α mRNA表达明显低于PN12h组(P＜0.05)，而其他时间点EN组和PN组对比未有统计学差异(P＞0.05); PN组IL-6 mRNA表达均高于同时间点EN组(P＜0.05);相反地，PN组IL-10mRNA表达均低于同时间点EN组(P＜0.05)。在EN组和PN组各自亚组间比较中:TNF-α mRNA水平均在12h组最高(P＜0.05)，其余二组未有明显差异(P＞0.05); IL-6 mRNA水平均在48h组最高，12h组最低(P＜0.05); IL-10mRNA水平均在24h组最高(P＜0.05)，PN48h组IL-10mRNA表达高于PN12h组(P＜0.05)，而EN12h组和EN48h组比较无明

目录

摘要

第一章 前言

第二章 SD大鼠重度急性胰腺炎动物模型的建立

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 早期肠内营养对重度急性胰腺炎大鼠TNF-α、IL-6和IL-10表达水平的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 全文总结

参考文献

第六章 附录

攻读学位期间成果

致谢

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