早期鼻咽癌基因甲基化谱构建及其在早期诊断中的作用探讨

摘要

背景与目的： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种极具特色的肿瘤，具有复杂的病因学及奇特的地理分布，是我国华南地区发病率最高的头颈部恶性肿瘤。其预后与分期密切相关，Ⅰ期患者与Ⅳ期患者的5年生存率相差甚远，Ⅰ期5年生存率约为93％，Ⅳ期病人5年生存率仍仅为40％左右。因鼻咽部解剖结构特殊性，鼻咽癌早期诊断相对困难，患者往往因临床症状就诊时已是中晚期，尽管目前放射治疗的设备和技术有较大的发展和改进，同时也采用了与手术、化疗相结合的综合治疗，但晚期患者的5年生存率仍未得到明显提高，其与早期患者5年生存率的差距仍较大，而临床实践显示鼻咽癌的早期（Ⅰ期占4.8％、Ⅱ期占25.2％）诊断率低于30％。因此在目前病因不明无法进行一级预防的情况下，提高早期诊断率是提高生存率的关键因素之一，寻找更加特异和敏感的指标来筛查、诊断早期鼻咽癌，成为临床亟待解决的问题。 目前公认鼻咽癌的发生是遗传、环境及EB病毒相互作用的结果，其发生、发展乃至转移等是一个多基因参与的过程;EB病毒VCAIg-A等指标应用于高风险区风险预测，但其筛选率低、假阳性率高等特点使其不能很好的满足临床工作的要求，近年来针对NPC的表观遗传学研究显示相关基因的沉默在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用，主要表现在抑癌基因启动区CpG岛的高甲基化导致表达下调或失活，肿瘤抑制功能丧失，从而引发肿瘤;研究还发现此类基因异常甲基化的在肿瘤发生前即可出现，如p16、MGMT在肺鳞状细胞癌患者确诊前35个月即可在患者唾液中检测到其异常。事实上基因甲基化是一个十分复杂的基因表达调控机制，基因启动子甲基化等分子生物标记物检测正逐步应用到肿瘤的早期诊断、转移复发及预后上来，某些肿瘤在未恶变之前就已经发生了甲基化的改变，且经过代谢释放出来;早期对疑似恶变的患者进行基因甲基化的相关检测，寻找早期癌甚至是癌前病变阶段肿瘤的甲基化改变，并给予适当的处理，很有可能存肿瘤的防治特别是在肿瘤的早期诊断方面发挥积极作用;因此深入研究明确甲基化改变与肿瘤发展的相关性，对肿瘤的早期诊断与筛查以及判断肿瘤转移复发、预后等方面有深远意义。而研究显示基因甲基化在鼻咽癌发生发展中是常发事件，启动子区DNA过甲基化是肿瘤发展早期的一种常见表观遗传学现象，可引起相关的基因沉默。因此对DNA过甲基化的测定可作为早期诊断鼻咽癌的一种标志，如能确定导致鼻咽癌或在鼻咽癌早期阶段出现的异常甲基化基因，对无明显症状鼻咽癌或预测鼻咽癌发生具有重要意义，可提高鼻咽癌的早诊率从而提高鼻咽癌患者的5年生存率。 以往由于基因甲基化检测标本分别是细胞系、荷瘤或各个临床分期混杂一起的临床标本，不能证明甲基化基因的发生时机，无法确定特定基因甲基化是否为鼻咽癌早期阶段的常发事件。同时由于临床上鼻咽癌的早期（Ⅰ、Ⅱ期）诊断率低于30％，早期鼻咽癌标本难以获得，特别是Ⅰ期鼻咽癌患者标本更为困难，因此如何通过基因检测的方法验证早期鼻咽癌患者中基因甲基化状况是目前研究热点，越来越多的研究开始关注高通量测序筛选鼻咽癌甲基化基因，譬如全基因组甲基化芯片的应用，致力于建立一个完整覆盖面广的甲基化谱，从而作为NPC早期诊断、转移、预后等的分子生物指标。 第一章Ⅰ期鼻咽癌DNA甲基化谱构建 目的： 本研究采用最新的甲基化DNA免疫共沉淀结合NimbleGen Human DNAMethylation3×720K CpG Island Plus RefSeq Promoter Array对早期鼻咽癌石蜡标本进行高通量测序分析，筛选出甲基化基因，初步构建出早期鼻咽癌基因甲基化谱。 方法： 收集4对Ⅰ期鼻咽癌石蜡标本及正常对照鼻咽组织，分别提取DNA后质检合格;富集两组样品基因组甲基片段后采用NimbleGen Human DNA Methylation3×720K CpG Island Plus RefSeq Promoter Array对2组标本进行高通量测序分析，对杂交信号进行扫描及初步数据处理，分析早期鼻咽癌癌与配对正常鼻咽粘膜组织的基因组DNA甲基化差异，最终筛选出两组间差异甲基化谱。 结果： 通过甲基化芯片初步筛选，鼻咽癌石蜡标本中在全部4例标本中均出现甲基化的数目是1242个，而在正常对照鼻咽组织C1-C4中均出现甲基化的数目是2260个。同时筛选出早期鼻咽癌与正常鼻咽组织间差异表达甲基化基因249个，筛选基因位于不同的染色体上，其中定位在19号染色体上的甲基化差异基因最多，其基因数达到34个，占所有筛选出甲基化差异基因的比例为13.65％;另外定位在1、2、11、16、17号染色体上的甲基化差异基因数目也比较多，分布均在10个以上;而定位到4号、8号及21号染色体上的甲基化差异基因最少，分别只有2个，所占的比例只有0.80％。 结论: 本研究初步构建了早期鼻咽癌的基因甲基化谱，获得了两组间差异化甲基化基因，为进一步建立更为精确的鼻咽癌甲基化谱奠定了基础，同时差异化甲基化基因也为寻找新的鼻咽癌分子标志物提供了可能。 第二章部分甲基化芯片结果的初步验证 目的: 旨在通过甲基化特异性PCR(MSPCR)对基因芯片筛选的部分甲基化差异基因进行验证，探讨基因甲基化在鼻咽癌早期诊断与发展中的作用，进一步寻找鼻咽癌早期肿瘤分子标志物，最终提高鼻咽癌早期诊断并改善其临床疗效。 方法: 收集35例确诊的Ⅰ期鼻咽癌患者标本信息，病理科切取石蜡切片，检索文献同时从庞大的基因芯片数据中筛选出RASSF1A、 DAPK、CHFR、CDH1、C DH13、WIF1、RIZ1、PGP9.5、KIF1A、IQCG、LMLN、P16、MGMT、EBNA-1、LMP-1、DLEC、EGOT、SNORD66等18个差异甲基化基因，通过MSPCR方法检测上述18个基因在35例早期鼻咽癌中甲基化情况。同时通过条件摸索建立多重MSP方法(multiplex-MSP)，尝试实现多个基因甲基化表达谱的快速高通量检测;具体我们对退火温度相近而扩增片段大小不同的基因进行多重MSP尝试。 结果: 35例Ⅰ期鼻咽癌标本中甲基化程度最高的是KIF1A、CDH13，全部标本都发生甲基化，甲基化率100％，其中CDH13全部为不完全甲基化，而KIF1A则为全是完全甲基化;甲基化程度最低的是IQCG,全部标本中均未发现甲基化情况，甲基化率为0;而甲基化率超过50％以上的基因有10个，其分别是DAPK(54.30％)、RIZ1(57.10％)、EBNA-1(60.00％)、WIF1(62.90％)、SNORD66(68.60％)、PGP9.5(71.40％)、DLEC(74.30％)、RSSF1A(74.30％)、CDH1(80.00％)、LMP-1(97.10％)、CDH13(100.00％)、KIF1A(100.00％)。 MMSPCR扩增均得到理想结果，与预期相符。 结论: MSPCR验证结果与甲基化芯片扫描结果具有相似性，初步证实芯片结果的可靠性;MMSPCR扩增均得到理想结果，与预期相符。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 甲基化芯片检测Ⅰ期鼻咽癌DNA甲基化分布

一、材料

二、方法

三、结果

第二章 甲基化芯片部分结果的验证

一．材料

二．方法

三．结果

讨论

结论

参考文献

附录图

中英文缩略词对照表

攻读硕士学位期间成果

致谢

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