HIV融合抑制剂ADS--J1的药物耐受机制及其与临床抗HIV药物的协同作用

摘要

艾滋病(AIDS)是一种由人类免疫性缺陷病毒(HIV)引起的一种后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重随机感染及/或继发肿瘤并致命的一种疾病。HIV病毒分为两种:HIV-1，HIV-2。HIV-1的毒性与传染性均高于HIV-2，因此目前主要针对HIV-1进行大量的研究。HIV-1为带有Ⅰ型膜融合蛋白的包膜病毒，它进入靶细胞首先是利用它的包膜表面gp120亚基与靶细胞主要受体CD4和辅助受体CCR5或者CXCR4先后发生结合，导致它的跨膜亚基gp41构象发生改变，其N端融合肽插入到宿主细胞膜中，gp41形成gp41 NHR三聚体形式的中间态，然后，gp41的NHR和CHR区域形成稳定的6-HB结构，引起病毒包膜与靶细胞膜的融合。在gp41 NHR的沟槽内有一个深的疏水口袋区域，并且这个区域对于HIV-1病毒的膜融合和6-HB的稳定性非常关键，因此，这个疏水区被认为是发展HIV融合抑制剂的重要靶点。 利用计算机辅助设计，将gp41口袋区作为靶点，并结合本室建立以ELISA为手段的gp416HB抑制实验，Jiang等人成功地筛选出ADS-J1小分子化合物，它抑制HIV介导的细胞融合和HIV-1复制活性达到低微摩尔水平。机制研究表明，ADS-J1能够和一个可溶性杂交分子IQN17结合，并且能够显著抑制PIE7与IQN17口袋区特异性地结合。IQN17是由GCN4序列和形成疏水口袋区的N-多肽N17联接组成，它可以模拟形成gp41三聚体上的口袋区结构。PIE7是一个能与IQN17口袋区特异性地结合的短肽。另外，ADS-J1能够阻止衍生于病毒gp41 NHR和CHR多肽所模拟的6-HB的形成。计算机模型分析表明，ADS-J1的磺酸基团能够与gp41口袋区的第574位带正电荷的赖氨酸(K574)结合，但是将带负电荷的氨基酸替代K574后则完全消除了ADS-J1与gp41口袋区的结合。 然而，Este等人认为ADS-J1既不作用于gp41口袋区，也不作用于gp41其它区域，而是靶向gp120的V3区域。这主要源于他们没有诱导出突变点位于gp41口袋区的ADS-J1抗性株，相反，他们诱导出了位于gp120 V3区域的ADS-J1抗性株。然而，他们选用的HIV-1病毒株是AR177（靶向gp120的抑制剂）抗性株或者相关病毒株作为野生型毒株，在ADS-J1存在下，侵染MT-4细胞进行诱导突变。由于他们没有设计一个靶向gp41口袋区的肽或者小分子化合物作为对照，因此这些结果不是令人信服的。 因此，本课题主要以ADS-J1为研究对象，利用gp41口袋区的假病毒突变株和HIV-1 T-2635耐药性病毒株，探讨了ADS-J1的耐受机制。另外，对ADS-J1进行了抑制T-20耐受株、HIV-1临床分离株的活性研究。同时，进行了将ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1ⅢB和HIV-1Bal的活性研究，评估了它们潜在的协同效应。 实验方法: 1) Gp41口袋区Q64和A67突变对ADS-J1抑制HIV-1病毒活性的影响。利用FuGENE(@)6转染试剂转染的方法，对以前构建好的假病毒Q64A，Q64L，A67G和A67S进行病毒包装;测定标准p24蛋白的不同浓度与对应的A450值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出假病毒中p24蛋白的含量;将浓度为250 ng p24/ml的假病毒与1×105/ml的TZM-B1细胞共同培养，测定假病毒感染性;将浓度为250 ng p24/ml的假病毒，与不同浓度的ADS-J1，对照抑制剂C34、T20分别孵育30 min，加入密度为1×105/ml的TZM-B1细胞，感染72 h后，测定相应的荧光吸收值，采用Calcusyn软件计算IC50。 2) T-2635耐药株对ADS-J1抑制HIV-1病毒活性的影响。采用CaCl2转染的方法将T-2635耐药株质粒转染至293T细胞中，72h后收集T-2635耐药株上清病毒粒子，然后将其侵染MT-2细胞，进一步扩增病毒，根据CPE现象，在感染4-7天后收集病毒上清;根据标准曲线计算出T-2635耐药株p24蛋白的含量;在测定这些抗性株具有感染性后，将浓度为5 ng p24/ml的T-2635耐药株与不同浓度的ADS-J1，对照抑制剂T2635、AZT分别孵育30 min，加入密度为1×105/ml的TZM-B1细胞，感染72 h后，测定相应的荧光吸收值，采用Calcusyn软件计算IC50。 3) N36Fd和它的突变体N36(Q64A)Fd，N36(Q64L)Fd，N36(A67G)Fd，N36(A67S)Fd，N36(Q66R)Fd构建、蛋白表达和纯化。采用PCR方法分别扩增出Fd片段、N36及其突变体片段，然后进行二次PCR将N36及其突变体分别和Fd片段连接上，构建出N36Fd和它的突变体;在0.1mM诱导剂IPTG存在下，采用原核表达的方法，表达出上述6种蛋白;利用Glutathione-Sepharose4B层析柱以及3KD、30KD浓缩管，进行蛋白的浓缩、纯化。 4)天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)检测ADS-J1对N36Fd及其突变体和C34相互结合形成的复合体6-HB的抑制作用。将N36Fd及其突变体分别加入PBS或者不同浓度的ADS-J1，孵育30 min后，加入C34在共同孵育30min。N36Fd及其突变体蛋白、C34终浓度为10μM。孵育好的样品混合液与2×Native sample buffer等体积混匀，加样于预制的18％Tris-glycine gel孔中。恒压125 V，室温下电泳2h。用染色剂考马斯亮蓝R250染色2h，脱色后用FluorChem8800凝胶成像仪拍照记录。 5)圆二色光谱(CD)检测ADS-J1对N36Fd及其突变体和C34相互结合形成的复合复合螺旋构象的干扰作用。将N36Fd及其突变体分别加入PBS或者不同浓度的ADS-J1，孵育30min后，加入C34在共同孵育30 min。N36Fd及其突变体蛋白、C34终浓度为10μM，ADS-J1终浓度为50μM。参数设置:检测温度:4℃;样品池:0.1 cm;波长扫描范围:180-300nm;波宽:5.0 nm;狭缝0.1 nm;时间常数4.0 s;扫描速度:50 nm/min。将孵育好的样品加入CD特定比色皿中，进行CD波长扫描，保存CD信号[θ]222 nm值，并计算出α-螺旋值。 6)等温滴定量热技术(ITC)检测ADS-J1对N36Fd和它的突变体的结合能力。将50μM的N36Fd或者它的突变体蛋白加入样品池中，将750μM ADS-J1逐滴滴入至样品池中。设置滴定间隔为200 sec，滴定体积为10μL/滴，搅拌速度是350rpm。用软件Launch NanoAnalyze计算热力学常数。 7) ADS-J1抑制HIV-1T-20耐药株活性检测。利用MT-2细胞扩增出HIV-1 T-20耐药株后，根据标准曲线计算出p24蛋白的含量，按照Reed& Muench法计算病毒TCID50。将100倍50％组织感染浓度TCID50的HIV-1 T-20耐药株，与不同浓度的ADS-J1，阳性对照T20分别孵育30 min，加入密度为1×105/ml的MT-2细胞，感染4天后，观察细胞病变效应CPE，取培养上清，并加入等量5％ TritonⅩ-100裂解病毒，ELISA方法测定上清中p24抗原含量，采用Calcusyn软件计算IC50。 8) ADS-J1抑制HIV-1临床分离株活性检测。利用CEMx1745.25M7细胞扩增出HIV-1临床分离株后，根据标准曲线计算出p24蛋白的含量，按照Reed& Muench法计算病毒TCID50。将100倍50％组织感染浓度TCID50的HIV-1临床分离株与不同浓度的ADS-J1，阳性对照T20分别孵育30 min，加入密度为5×105/mL的CEM(x)1745.25M7细胞后，培养7天后取培养上清，并加入等量5％ TritonⅩ-100裂解病毒，ELISA方法测定上清中p24抗原含量，采用Calcusyn软件计算IC50。 9) ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1ⅢB的活性检测。利用MT-2细胞扩增出HIV-1ⅢB后，根据标准曲线计算出p24蛋白的含量，按照Reed& Muench法计算病毒TCID50。将不同浓度的ADS-J1和不同机制的抗病毒药物混合液倍比稀释，加入100倍50％组织感染浓度TCID50的HIV-1ⅢB，孵育30 min后加入密度为1×105/ml的MT-2细胞，感染4天后，观察细胞病变效应CPE，取培养上清，并加入等量5％ TritonⅩ-100裂解病毒，ELISA方法测定上清中p24抗原含量，采用Calcusyn软件计算IC50。 10) ADS-J1与不同机制的抗病毒药物联合应用时抑制HIV-1Bal的活性检测。利用CEMx1745.25M7细胞扩增出HIV-1Bal后，根据标准曲线计算出p24蛋白的含量，按照Reed& Muench法计算病毒TCID50。将不同浓度的ADS-J1和不同机制的抗病毒药物混合液倍比稀释，加入100倍50％组织感染浓度TCID50的HW-1 Bal，孵育30 min后加入密度为5×105/mL的CEMx1745.25M7细胞，培养7天后取培养上清，并加入等量5％ TritonⅩ-100裂解病毒，ELISA方法测定上清中p24抗原含量，采用Calcusyn软件计算IC50。 实验结果: 1) Gp41口袋区带有突变点的假病毒侵染性降低，且这些假病毒对ADS-J1和C34具有高的抗性，但对T-20却相对敏感的。单次感染实验结果表明，与野生型相比，带有突变点病毒的感染性有显著性差异，并具有统计学意义（F=604，P＜0.001），Q64A和Q64L的突变使HIV-1假病毒的侵染能力大概只有野生型病毒的34％和27％，A67G和A67S的突变使使HIV-1假病毒的侵染能力大概只有野生型病毒的57％和31％。所有的突变株假病毒对ADS-J1和含有口袋区的C肽C34产生高的抗性，其中对ADS-J1了30-91倍的抗性，对C34产生了103-244倍的抗性，而对不含口袋区的C肽T-20相对敏感的，以上结果表明ADS-J1可能主要作用于HIV-1 gp41NHR的口袋区。 2) T-2635耐药株也对ADS-J1产生了抗性。我们选择了7株带有单突变点，4株带有双突变点，和2株带有多突变点的T2635耐药株对T2635，ADS-J1，AZT（逆转录酶抑制剂做为对照）的进行敏感性检测。实验结果表明，单突变株对T2635产生一定抗性，为4到7倍的抗性，双突变株对它产生了较高的抗性，为13到23倍，而多突变株对它产生了非常高的抗性，达到36到263倍，这些与以前报道一致。与T2635相似的是，随着突变点的增多，对ADS-J1产生的抗性也相应增加。相关性分析表明，这些病毒株对T2635和ADS-J1抗性具有相关性(r=0.946，P＜0.001)。这些结果说明，ADS-J1和T2635可能有相似的作用机制，都是作用于gp41区域。 3) N36Fd和它的突变体的构建。通过两次PCR反应，构建了编码N36Fd和它的突变体基因片段。然后将其插入带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的pGEX-6P-1表达载体中，经测序鉴定后筛选出了具有正确序列的克隆载体N36Fd-pGEX6p-1, N36(Q64A)Fd-pGEX6p-1, N36(Q64L)Fd-pGEX6p-1,N36(A67G)Fd-pGEX6p-1,N36(A67S)Fd-pGEX6p-1，和N36(Q66R)Fd-pGEX6p-1。利用原核表达蛋白的方法，表达出了N36Fd及其突变体蛋白，纯化后采用聚丙烯凝胶电

目录

摘要

前言

第一章 带有Q64和A67突变位点的HIV-1假病毒和T2635耐药病毒株对ADS-J1抗性研究

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

第二章 编码N36Fd突变体的载体构建，蛋白表达纯化及突变体对ADS-J1活性影响

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

第三章 ADS-J1对抗T-20耐药株和HIV-1临床分离株

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

第四章 ADS-J1与临床抗艾滋病毒药物的协同作用

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

讨论

结论

参考文献

中英文缩写词对照表

成果

致谢

声明

论文统计学合格证明