慢性阻塞性肺疾病患者中性粒细胞的异常极性化及香烟提取物诱导中性粒细胞极性化的机制探讨

摘要

背景：
　　慢性阻塞性肺疾病(COPD)严重危害人类的健康，由其所引起的死亡人数占全球死亡人数的5％，是造成慢性疾病高发病率和死亡率的重要因素之一。世界卫生组织预计慢性阻塞性肺疾病(COPD)造成的死亡在未来的十年将会增加30％。课题组已经从肺组织的上皮细胞、内皮细胞等多个角度对其发病机制展开研究，而发病过程中趋化因子对嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞(PMNs)的募集及其造成的炎症反应可能也是慢性阻塞性肺疾病(COPD)疾病启动和迁延的重要原因，另一方面COPD外周血嗜中性粒细胞(PMNs)迁移也存在着异常，表现为迁移的速度明显增加但向趋化物方向迁移的数量降低，这导致嗜中性粒细胞(PMNs)在整个肺组织中非定向的异常聚集，引起肺部的非特异性炎症并损伤肺组织导致气道炎症及肺气肿。
　　中性粒细胞是先天免疫应答的重要组成部分，是机体抵御外来微生物病原体尤其是化脓性细菌的入侵的第一道防线。极性化形态的建立是中性粒细胞定向迁移到炎症部位，发挥杀菌抗炎作用的前提，但中性粒细胞不恰当的激活却与临床上一些疾病例如败血症、哮喘、缺血/再灌注损伤、类风湿性关节炎、过敏反应等密切相关。因此深入探讨COPD患者中性粒细胞极性化情况及极性化过程的信号机制，对寻找新的治疗和干预靶点，防止中性粒细胞不适当激活导致的组织损伤具有重要意义。
　　吸烟在慢阻肺发病的危害作用被大量证实，广东部分地区慢阻肺的流病学研究显示，吸烟人群中仅有15.1％患慢阻肺，且吸烟量对慢阻肺患病率影响无统计学意义。已有文献报道，在SOCE通过Akt-Src-Rho-GTPase信号通路参与fMLP刺激下的中性粒细胞的极性化，那么香烟提取物(CSE)引起的中性粒细胞的极性化趋化状态是否与SOCE引起的Akt通过或Src通路的活化有关呢？这对于阐明吸烟在慢阻肺疾病的发病和致病机制中有一定的意义。
　　目的：
　　1.观察正常不吸烟人群、正常吸烟人群和不同GOLD分级慢阻肺病人外周静脉血中性粒细胞的极性化（自发极性化率以及fMLP梯度浓度刺激下的定向极性化率）的差异。
　　2.检测正常不吸烟人群、正常吸烟人群和不同GOLD分级慢阻肺病人外周静脉血中性粒细胞内钙库操纵性钙内流(SOCE)重要功能成分:基质交联分子(STIM)1、2和Orai1的表达是否有差异。
　　3.检测正常不吸烟人群、正常吸烟人群和不同GOLD分级慢阻肺病人外周静脉血中性粒细胞内钙库操纵性钙内流(SOCE)所引起的细胞钙内流情况是否有差异。
　　4.通过检测PI3K的下游标志信号分子Akt磷酸化水平以及Src磷酸化，及PI3K抑制剂和Akt抑制剂作用下香烟提取物诱导中性粒细胞的极性化情况，探讨香烟提取物(CSE)刺激下中性粒细胞的极性化是否受经典的PI3K信号通路调控。
　　5.探讨SOCE抑制剂对香烟提取物刺激下中性粒细胞极性化、Akt磷酸化及Src磷酸化水平及细胞内钙信号的作用。
　　方法：
　　1.采用经典的梯度密度离心的方法分离中性粒细胞，主要包括红细胞沉降，淋巴细胞分离液密度梯度离心和低渗裂解残存的红细胞三个步骤。首先葡聚糖T-500（Dextran T-500）沉降红细胞可以除去绝大多数红细胞，接下来淋巴细胞分离液密度梯度离心可将外周血单个核白细胞与多型核白细胞分开，残存的红细胞通过低渗溶解快速移除。获得的中性粒细胞分别进行台盼蓝和瑞氏染色，分析细胞的活性和纯度。细胞纯度和活力分别大于95％和98％。
　　2.中性粒细胞用或不用2-APB，SKF96365，Ly249002或Deguelin预处理30分钟，采用Zigmong Chamber建立fMLP或者香烟提取物(CSE)的线性浓度梯度，观察中性粒细胞受到相应刺激后细胞形态变化及极性化情况。
　　3.运用FV1000激光共聚焦显微镜(LSCM)检测细胞内钙离子的方法检测不同组志愿者中性粒细胞及2-APB，SKF96365对TG刺激SOCE和香烟提取物(CSE)刺激的钙内流的影响。
　　4.通过Western blot的方法，用2-APB，SKF96365，Ly249002或Deguelin处理中性粒细胞30min，观察其对香烟提取物(CSE)刺激的Akt磷酸化及Src磷酸化的影响。
　　结果：
　　1.慢阻肺Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级志愿者的外周血中性粒细胞在没有fMLP梯度浓度刺激下发生的自发极性化率均显著高于健康不吸烟组、健康吸烟组。[（15.70±8.01）％，P＜0.05，（27.50±11.99）％、（24.21±8.45）％、（18.13±6.56）％比（7.99±3.91）％、（5.76±4.81）％，均P＜0.01];健康不吸烟组与健康吸烟组自发极性化率差异无统计学意义。
　　2.在fMLP梯度浓度刺激下，各组外周血中性粒细胞向刺激来源fMLP方向发生的定向极性化的比例均显著低于健康不吸烟组和健康吸烟组[(2.75±1.27)％，（3.52±1.29）％、（3.83±1.82）％、（3.06±0.62）％比（7.44±3.31）％、（8.44±3.47）％，均P＜0.01]。健康不吸烟组与健康吸烟组在fMLP梯度浓度刺激下的定向极性化率差异无统计学意义。
　　3.四个慢阻肺疾病组中性粒细胞由TG引起的内质网钙库清空导致的细胞内钙水平升高程度较两对照组降低约30％，由此引起的细胞外钙内流即SOCE与对照组相比降低约60％。
　　4.四个慢阻肺组SOCE的重要组成成分:基质交联蛋白(STIM)1、2及Orai1表达均显著高于健康不吸烟组、健康吸烟组（均P＜0.01）。
　　5.0.5％的香烟提取物引起中性粒细胞最大定向极性化率。对照组中性粒细胞在香烟提取物(CSE)梯度浓度刺激下的定向趋化极性化率为(41.49±4.76)％;而用SKF96365(40μ M)或2-APB(100μ M)预处理30min后，中性粒细胞的定向趋化极性化率分别降至(19.09±1.83)％和(14.06±1.62)％(P=0.000; P=0.000)，存在明显统计学差异。
　　6.TG刺激的中性粒细胞内质网清空引起了细胞内钙水平升高，即第一个峰时对照组和药物处理组（SKF96365及2-APB）的相对值无统计学差异(F=1.556，P=0.285);而第二个峰，即SOCE所引起的细胞内钙水平的相对值统计分析后发现，（F=14.941，P=0.000），对照组的相对值分别被SKF96365及2-APB抑制了30％和45％左右(P=0.000; P=0.000)。将刺激物TG换成CSE，钙库清空所致的第一个峰，对照组和药物处理组(SKF96365及2-APB)的相对值无统计学差异（F=2.082，P=0.206）;而对第二个峰所选取的相对值统计分析后发现，(F=749.394，P=0.000)，对照组的相对值分别被SKF96365及2-APB抑制了30％和60％左右(P=0.000; P=0.000)。
　　7.与对照组相比，中性粒细胞经梯度浓度的香烟提取物刺激后细胞极性化率显著性上调(F=66.533，P=0.000)。用PI3K抑制剂(Ly249002)和Akt抑制剂(Deguelin)预处理中性粒细胞30min后，与未处理组相比，香烟提取物刺激的细胞定向极性化率显著性降低(P=0.000; P=0.000)。
　　8.香烟提取物不同刺激时间点间的Akt磷酸化及Src磷酸化的相对值有统计学差异(F=6.376，P=0.004; F=41.57，P=0.000)，LSD法两两比较发现CSE刺激15min时Akt或Src的磷酸化相对于control组（CSE刺激0s）显著增高（P=0.000; P=0.000）;从均值上看，CSE刺激15min时的Src以及Akt磷酸化相对值达到最高。
　　9.与对照组相比，经香烟提取物刺激的中性粒细胞的Akt和Src磷酸化水平显著升高（F=4.681，P=0.013）。SKF96365和2-APB预处理中性粒细胞后，与未处理组相比，CSE刺激的Src磷酸化的水平显著性降低(P=0.011;P=0.036)。而不同药物处理组的Akt磷酸化相对值无明显统计学差异，从均值上看，各药物处理组的Akt磷酸化均较CSE刺激组降低。
　　结论：
　　1.与健康不吸烟组与健康吸烟组相比，慢阻肺患者的外周静脉血中性粒细胞自发极性化率明显增高而定向极性化率明显降低，即慢阻肺患者的中性粒细胞呈现出大量而不精准的极性化趋化状态。
　　2.与健康不吸烟组与健康吸烟组相比，慢阻肺患者外周静脉血中性粒细胞钙库操纵性钙内流(SOCE)的重要功能组分基质相互作用分子(STIM)1、2和Orai1蛋白表达明显升高;且由其引起的细胞内钙水平升高的峰值明显降低。即，慢阻肺患者的中性粒细胞SOCE的组分和功能存在异常。
　　3.SOCE在CSE刺激的中性粒细胞极性化中扮演不可或缺的作用，抑制SOCE可以显著的抑制CSE刺激的中性粒细胞的极性化趋化运动。
　　4.在CSE刺激的中性粒细胞极性化过程中，SOCE主要通过非Akt信号，即Src信号通路起作用，同时，Akt通路的活化在调控细胞极性化的发生起到重要作用。

目录

摘要

前言

材料与方法

第—节 实验材料

第二节 实验方法

结果

第一节 慢阻肺患者中性粒细胞的极性化及SOCE介导的钙信号异常

第二节 SOCE抑制剂对香烟提取物诱导的中性粒细胞极性化的影商

第三节 Akt通路及Src通路参与香烟提取物诱导的中性粒细胞极性化

讨论

全文小结

参考文献

英文缩略词表

致谢

目前已获得的主要成果

声明