第二代高通量测序分析VVC及RVVC患者阴道菌群结构

摘要

女性生殖道是人体四大生态系统中较复杂的一个生态系统，由阴道解剖结构、内分泌调节以及微生态菌群共同组成。由于受到环境变化、药物刺激、宿主的激素水平和免疫状态等因素的影响，女性生殖道内的微生态菌群平衡状态被打破而失衡，从而导致疾病的发生。全面了解阴道微生态的菌群组成以及动态变化，有助于我们了解生殖道感染疾病的发生、发展过程，进一步指导临床采取及时的干预措施，使用适当的药物治疗，避免滥用药物治疗。
　　由于阴道菌群主要为厌氧茵，培养营养条件要求苛刻，使用传统培养和分离鉴定的方法很难全面认识阴道菌群构成，限制了对阴道微生物群落菌群多样性与疾病关系的进一步研究。微生物的分类鉴定从表型特征鉴定深化为基因特征鉴定。16S rRNA基因聚合酶链反应(PCR)扩增是目前最常用的检测阴道微生物的非培养法。我们通过Illumina Solexa高通量测序平台测序、结合带标签的基于荧光测序平台的双末端测序(BIPES)，可快速、全面了解阴道微生物群落结构信息，
　　外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)是由假丝酵母菌引起的一种常见的外阴阴道炎性疾病，约有5％发展为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)。因其引起瘙痒等症状影响妇女的工作和生活，又因其容易反复发作经久不愈成为临床研究的一个难点。VVC、RVVC的发病与多种因素有关，发病机制仍未明确，目前研究提示与阴道内自身微生物菌群的结构及微环境变化有关。但假丝酵母菌感染后阴道菌群是否发生改变，如何改变，目前仍无定论。本研究通过Illumina高通量测序技术以及BIPES的序列研究方法，比较了解健康育龄女性、VVC和RVVC患者的微生物群落结构，追踪健康育龄女性以及VVC患者阴道菌群随月经周期的动态变化，为进一步探讨VVC和RVVC的病因、治疗以及预防提供理论依据。
　　目的：
　　1、通过Illumina高通量测序技术以及BIPES的序列研究方法，了解健康育龄女性、VVC和RVVC患者阴道微生物菌群的结构，分析阴道菌群的多样性改变，了解VVC和RVVC患者在发作时期阴道菌群与健康育龄女性的差异。
　　2、追踪健康育龄女性、VVC患者在月经周期变化中的阴道菌群结构信息，探讨其菌群结构动态变化的模式及与月经周期的关系。
　　方法：
　　1.实验对象:
　　实验一:
　　选取2013年4月～2013年10月就诊于佛山市顺德区第一人民医院妇科门诊的患者12例，平均年龄（28.83±6.10）岁。VVC组5例，纳入标准:①症状:外阴瘙痒、灼痛，伴有尿痛以及性交痛等症状:阴道分泌物增多。②体征:外阴潮红、水肿，可见抓痕，甚至皲裂，小阴唇内侧及阴道粘膜附着白色膜状物，阴道内较多的白色分泌物，呈凝乳状或豆腐渣样。③实验室检查:阴道分泌物镜检找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝，或培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。RVVC组5例，纳入标准:①1年中发作VVC≥4次。②实验室检查:阴道分泌物镜检找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝，或培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。健康组(Healthy)2例，纳入标准:①无临床症状。②阴道清洁度为Ⅰ～Ⅱ级。③实验室检查:阴道分泌物镜检未找到假丝酵母菌的芽孢或菌丝。
　　实验二:
　　2013年6月～2013年9月就诊于佛山市顺德区第一人民医院妇科门诊体检的健康女性2名，平均年龄(27.00±3.00)岁，纳入健康组(Healthy)。纳入标准:①～③同实验一;④月经正常。VVC组3例，平均年龄(29.00±4.16)岁。纳入标准:①～③同实验一;④月经正常。
　　以上各组均为我国汉族人，排除标准:研究对象1个月内无全身应用抗生素及阴道局部用药史，3天内无性生活史以及阴道灌洗;排除妊娠期、哺乳期;排除全身系统性疾病如:糖尿病、激素治疗性疾病（如急慢性肾炎）等;排除滴虫性、细菌性阴道病或需氧型阴道炎等。另外实验二还需满足以下条件:目前均只有一个性伴侣，采用避孕套避孕或自然避孕法，无口服避孕药物。
　　2.取样:实验一、实验二各组研究对象知情同意后，用无菌阴道棉拭子于阴道壁中上段取阴道分泌物，标本送检。实验二研究对象的取样时间是月经周期中的第2、4、7、14、16、21、27天。
　　3.所有标本采用DNA提取试剂盒（深圳易瑞）提取样本总DNA，具体操作步骤参照说明书。
　　4.16s rRNAV4区基因片段的扩增及Illumina测序:以样本总DNA为模版，采用引物514F和805R，扩增其中的16S rRNA V4区基因。PCR产物以相等的终浓度混合均匀，通过Illumina HiSeq2000平台进行双末端100bp测序（华大基因，深圳）。
　　5.测得序列经过BIPES流程进行初步处理。使用TSC进行聚类，提取出每个操作分类单元(Operational taxonomy unit，OTU)的代表序列后，利用GAST进行物种的分类，其中属于乳酸菌属的OTU利用megablast进一步分到种级别，后续分析包括聚类分析，Alpha多样性和Beta多样性分析。基于Unifrac距离，采用QIIME进行阴道菌群主分分析。采用linear discriminant analysis(LDA)coupled with effect size measurements(LEfSe)在线工具分析患者特殊的阴道菌群。
　　6.统计学处理:应用SPSS13.0软件进行统计分析，计数资料采用率或构成比表示。计量资料组内或组间比较采用方差分析，对多样性指数、各菌属的相对丰度进行Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　实验一:
　　1.测序数据采用BIPES流程进行分析，采用UCHIME去除嵌合体序列，本实验测序样品数12个，最终共获得852992条序列，平均每个样品71083条。
　　2.根据QnME分析流程进行beta多样性分析，展示三组菌群之间的相似度。VVC组菌群Beta多样性最高，分布广泛。RVVC组分布紧凑，菌群结构相似度高。健康组Beta多样性介乎RVVC与VVC之间。
　　3.通过PD whole tree比较三组样品的Alpha多样性，分析显示VVC患者的阴道菌群Alpha多样性最高，提示其菌群Alpha多样性较RVVC及健康组明显增加(T-test，P＜0.05)。
　　4.在菌属的水平上，健康组主要以卷曲乳杆菌为优势菌，达95％以上。VVC组菌群构成呈现多样化改变，乳杆菌属丰富度显著降低，由最多的68％下降至0.2％，加德纳菌、普氏菌属、双歧杆菌丰富度明显增加。RVVC组菌群构成以惰性乳杆菌为优势菌，约占85％。
　　5.通过LEfSe统计三组菌属差异发现，VVC组的放线菌门、双歧杆菌属、双歧杆菌门以及金黄杆菌的丰度较RVVC和健康组明显增高。而嗜血菌属在健康组则明显增高。
　　实验二:
　　1.测序数据采用BIPES流程进行分析，采用UCHIME去除嵌合体序列，本实验测序样品数12个，最终共获得105796条干净序列，平均每个样品92610条。
　　2.分别用Chao1、Observed species、PD whole tree、Shannon四个指标展示5个研究对象在月经周期中阴道菌群的alpha多样性变化。其中健康组的H2和VVC组的V2的alpha多样性指数最低，说明阴道菌属构成相对单一。
　　3.通过计算欧式距离来展示5个研究对象在月经周期中阴道菌群的波动。在月经第2天的菌群结构与月经第7天明显拉开距离，提示月经第7天阴道菌群明显有变化，阴道优势菌群迅速生长，菌群的多样性由复杂化趋向于单一化。
　　4.在菌属水平上，随着月经周期变化，健康组主要以卷曲乳杆菌为优势菌，VVC组阴道菌群结构相对复杂，阴道优势菌群可为惰性乳杆菌(2/3)，也可为加德纳菌(1/3)。整个月经周期阴道菌群处于相互交替的动态变化中。阴道菌群多样性增高，则月经周期中菌群波动较明显。
　　5.选取OUT数量最多的前15位菌属，通过折线图可见5个研究对象阴道菌群在月经周期中的均有变化。阴道优势菌群的变化显示有2种模式:一种模式是相互交替变化:自月经期后阴道优势菌迅速生长至排卵期前达高峰，在排卵期（月经第14天）开始出现下降，至月经期达最低点，其他阴道菌群则相应增多;另外一种模式是保持绝对优势的模式。自月经期后，阴道优势菌大量生长，一直保持较高的丰富度，至月经前期才出现逐渐下降。
　　结论：
　　1.健康育龄女性和RVVC患者阴道菌群结构简单，VVC患者菌群多样性增高。
　　2.健康女性阴道优势菌群为卷曲乳杆菌，RVVC患者则以惰性乳杆菌为优势菌群。VVC患者阴道菌群的乳杆菌属比例降低，加德纳菌、普氏菌属、双歧杆菌等菌属丰富度增加。
　　3.阴道菌群随月经周期的变化而出现波动，以月经前后变化最大。阴道优势菌群变化呈现相互交替变化或保持绝对优势的模式。
　　4.在月经周期中健康育龄妇女仍以卷曲乳杆菌为优势菌群，而VVC组中以惰性乳杆菌或其他菌种为优势菌群，菌群多样性变化增高。
　　5.通过16S rRNA基因以及Illumina测序发现健康育龄妇女和VVC患者在月经周期中在阴道内一直存在卷曲乳杆菌与惰性乳杆菌，并与多种微生物共存。

目录

摘要

前言

第一章 VVC与RVVC患者阴道菌群结构的比较

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 VVC患者及健康育龄妇女月经周期中阴道菌群结构的动态变化

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

全文总结

参考文献

综述 外阴阴道假丝酵母菌病与乳酸杆菌的研究进展

附录

攻读学位期间成果

致谢

声明