IL-33在蛛网膜下腔出血后大鼠脑组织中的表达及在炎症反应中的可能作用

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分 IL-33在SAH后的表达、定位及可能作用
　　目的:
　　为检测IL-33的在SAH后的表达和定位情况，并探讨IL-33在SAH后可能作用。
　　方法:
　　1.实验动物及分组:使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠，大小约为280-320g按随机方法分为空白对照组和SAH组，其中SAH组又分为SAH模型建立后2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d7组。
　　2.SAH模型制作和组织的获取:采用视交叉前池注血模型，在相对应的时间点处死大鼠，选取视交叉前池有积血点的大鼠取颞叶皮质为标本。
　　3.Western blot analysis:利用凝胶电泳分离总蛋白，以检测空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点组IL-33、MyD88总蛋白的表达情况。利用凝胶电泳分离核蛋白，以检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点组NF-κB亚单位P65核蛋白的表达情况。
　　4.RT-PCR analysis:利用RNA提取试剂盒提取大鼠颞叶皮层脑组织的RNA，并进行定量分析;在使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，利用试剂盒并进行实时定量PCR反应，以检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血组各时间点大鼠颞叶皮层中IL-33和IL-1β mRNA表达情况。
　　5.免疫组化染色:制作组织切片，利用免疫组化染色方法检测在空白对照组和蛛网膜下腔出血后1天在大鼠颞叶皮层中IL-33表达量的变化，及IL-33在细胞内定位的情况。
　　6.免疫荧光双染:制备组织冰冻切片，利用免疫荧光双染方法检测空白对照组和蛛网膜下腔出血后1天IL-33在神经元细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达和分布情况。
　　结果:
　　1.动物实验数量分析:实验过程中空白组模型制作成功率100％，SAH组模型制作成功率75％;另外SAH组大鼠死亡率、视交叉前池无积血点比率分别为19.7％和6.8％。
　　2.SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33蛋白水平升高:IL-33蛋白水平在正常大鼠大脑颞叶皮质中呈低表达状态，SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33蛋白水平升高，在24小时出现峰点。与空白对照组相比，SAH后6h、12h、1d、2d、3d IL-33的蛋白水平有显著升高(p＜0.05)，具有统计学意义。
　　3.SAH引起大鼠大脑皮质中IL-33 mRNA、IL-1β mRNA水平升高，并且两者mRNA的改变趋势具有正相关:与对照组相比较，SAH后6h、12小时、1天、2天、3天的IL-33 mRNA水平显著升高(p＜0.05)，在24小时出现峰点.;而IL-1β mRNA水平在SAH后1天、3天、5天有显著性升高(p＜0.05)，也在24小时出现峰点。行统计分析发现两者变化趋势存在正相关，r=0.50，p＜0.05。
　　4.免疫组化示SAH后IL-33表达增多，IL-33定位于细胞核与细胞浆中:与空白对照组相比较在SAH后1天IL-33表达量增多(p＜0.05)，IL-33细胞阳性率分别为34.8％和67.9％;并且SAH后IL-33在细胞浆及细胞核中均有表达。
　　5.IL-33在神经元及星形胶质细胞中有表达，在小胶质细胞中不表达:大鼠大脑皮质中，在对照组和SAH后1天组中神经元及星形胶质细胞均有IL-33的表达，并且SAH引起IL-33表达量的升高(p＜0.05)。神经元中SAH组与对照组IL-33细胞阳性率分别为68.9％、46.4％;星形胶质细胞中比率分别为:26.7％、14.1％。小胶质细胞中无IL-33的表达。
　　6.SAH引起大鼠大脑皮质中总蛋白MyD88和核蛋白NF-κB p65蛋白水平升高，并且两者蛋白含量变化趋势与IL-33蛋白表达量的变化趋势均具有正相关。
　　结论:
　　1、SAH引起IL-33表达的升高;
　　2、IL-33定位在神经元和星形胶质细胞的细胞核与细胞浆中;
　　3、SAH后IL-33与IL-1β mRNA有正相关，IL-33与MyD88、NF-κBp65蛋白变化有正相关。
　　4、IL-33有可能通过IL-33→MyD88→ NF-κB p65通路参与SAH后的炎症反应过程。
　　第二部分 外源性IL-33在SAH后作用和可能作用机制
　　目的:
　　本实验为检测IL-33通过IL-33→MyD88→NF-κB途径参与蛛网膜下腔出血后的炎症反应的可能性，及IL-33对大鼠蛛网膜下腔出血预后的影响。
　　方法:
　　1.分组实及给药:使用成年雄性Sprague-Dawly大鼠，大小约为280-320g;按随机方法分为蛛网膜下腔出血组(SAH)、蛛网膜下腔出血+生理盐水组(SAH+Vehicle)、蛛网膜下腔出血+低剂量外源性IL-33组(SAH+LOW IL-33)、蛛网膜下腔出血+高剂量外源性IL-33组(SAH+HIGH IL-33)。SAH+Vehicle组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射无菌生理盐水10ul; SAH+LOWIL-33组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射外源性IL-3330ng（溶于10ul生理盐水中）;SAH+HIGH IL-33组在SAH模型制作后半小时往视交叉前池注射外源性IL-33300ng（溶于10ul生理盐水中）;SAH组模型制作后不再往视交叉前池注射任何液体。
　　2.SAH模型制作和组织的获取:采用视交叉前池注血模型，在模型制作后1天选取视交叉前池有积血点的大鼠取颞叶脑皮质为标本。
　　3.Western blot analysis:用于检测各组在蛛网膜下腔出血后1天MyD88总蛋白和NF-κB p65核蛋白的改变情况。
　　4.RT-PCR analysis:用于检测各组在蛛网膜下腔出血后1天MyD88和IL-1βmRNA的改变情况。
　　5.神经功能评分:在各组造模后24小时，进行神经功能评分，本实验使用Garcia评分系统，该评分最高评18分，最低3分;用于评估各组大鼠SAH的严重程度。
　　6.脑水肿测定:在蛛网膜下腔出血模型制作后1天处死大鼠，测定脑水肿，计算方法为([湿重-干重]/湿重]×100％);用于评估大鼠脑水肿严重程度。
　　7.统计学分析:采用统计软件SPSS13.0对数据进行分析，所有定量数据均以均数±标准误（(x)+SEM）表示，多组均数比较先采用单因素方差分析，接采用Dunnett-t检验，均以p＜0.05为有统计学意义。
　　结果：
　　1.动物实验数量分析:本实验原计划在使用48只大鼠，实际使用61只大鼠，在SAH组有3只大鼠死亡或者造模失败，模型制作成功率为80％;在SAH+Vehicle组有4只大鼠死亡或者造模失败，模型制作成功率为75％;在SAH+LOW IL-33组有4只大鼠死亡或者造模失败，模型制作成功率为75％;在SAH+HIGH IL-33组有2只大鼠死亡或者造模失败，模型制作成功率为85％.
　　2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88总蛋白表达量的升高:与SAH组相比SAH+Vehicle组MyD88总蛋白水平的改变并无显著性差异;与SAH组相比，SAH+LOW IL-33组与SAH+HIGH IL-33组MyD88总蛋白水平有显著升高(p＜0.05)。
　　3.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中NF-κB p65核蛋白表达量的升高:与SAH组相比较SAH+HIGH IL-33组NF-κB核蛋白有显著性升高(p＜0.05)。与SAH组相比SAH+Vehicle组与SAH+LOW IL-33组NF-κB核蛋白含量的改变并无显著性差异。
　　4.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88、IL-1βmRNA水平提高:与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组MyD88 mRNA水平有显著性提高(p＜0.05)， SAH+Vehicle组无显著性差异;与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组IL-1β mRNA水平有显著性提高(p＜0.05)，SAH+Vehicle组无显著性差异。
　　5.SAH后外源性IL-33引起大鼠神经功能评分降低:与SAH组相比SAH+HIGH IL-33组神经功能评分有显著性降低(p＜0.05)，SAH+Vehicle组、SAH+LOW IL-33组无显著性差异。
　　6.SAH后外源性IL-33加重大鼠脑水肿:与SAH组相比SAH+LOW IL-33组和SAH+HIGH IL-33组脑水肿显著性加重（p＜0.05）。与SAH组相比SAH+Vehicle组脑水肿无显著性差异。
　　结论:
　　1.SAH后外源性IL-33可引起MyD88总蛋白、NF-κB p65核蛋白表达量的升高
　　2.SAH后外源性IL-33引起大鼠大脑皮质中MyD88mRNA、IL-1βmRNA水平提高
　　3.IL-33可通过IL-33→MyD88→NF-κB通路参与SAH后的炎症反应过程
　　4.IL-33可能引起大鼠SAH的不良预后。

目录

摘要

第一部分：IL-33在SAH后的表达、定位及可能作用

1、背景

2、材料与方法

3、实验结果

4、讨论

第二部分：外源性IL-33在SAH后的作用和可能作用机制

1、背景

2．材料与方法

3、结果

4、讨论

参考文献

全文小结

综述 IL-33与中枢神经系统的关系

附录：英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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