血小板源性生长因子BB下调myocardin在低氧诱导的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化中的作用

摘要

背景和目的：
　　勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是常见的泌尿男科疾病，特别是45岁以上的男性患ED的风险性明显增高。导致ED的病因包括许多方面，如血管、神经、心理、内分泌等，近年来，血管因素越来越受到医生和患者的重视。阴茎海绵体与血管系统具有很多相似性，被认为是一种特殊的血管类组织。阴茎海绵体平滑肌(CCSM)是海绵窦间隙舒张及阴茎勃起的结构基础，在正常阴茎勃起的血流动力学变化中发挥着关键作用，同时CCSM为各种因素作用的终末组织，处于重要的核心地位。任何引起CCSM组织或细胞损伤的因素均可能导致患者ED的发生。
　　CCSM细胞表型转化可以改变海绵体的正常结构和功能，与ED的发生密切相关。平滑肌细胞表型转化是指:机体发育的不同阶段或不同疾病状态下平滑肌细胞所发生的形态、结构和功能的改变。CCSM细胞同血管平滑肌细胞(VSMC)有相似性，分为收缩型和合成型两种类型，并能根据细胞的局部环境变化重塑其表型，具有双向分化功能。CCSM细胞表型转化可改变细胞的收缩和舒张能力，并且使其合成细胞外基质的能力增加，促进海绵体纤维化，进而引起阴茎海绵体血流动力学发生改变，在器质性ED的发生发展过程中起非常重要的病理生理作用。
　　在众多可引起阴茎海绵体结构和功能改变的因素中，低氧容易被人们所忽视。低氧是指组织对氧的供求比例失调，氧供量减少，不足以维持组织的代谢、功能和结构的需要。低氧在各种病因引起的器质性ED过程中普遍存在，如糖尿病、睡眠呼吸暂停低通气综合征(Sleep Apnea Hypopnea Syndrome，SAHS)、前列腺癌根治术后神经血管束损伤、高原性低氧等;并且阴茎海绵体组织在疲软状态下本就处于低氧环境中，而是通过夜间勃起或者性兴奋勃起增加海绵体血流来改善阴茎海绵体的缺氧状态，避免其长期处于低氧环境中来维持良好的阴茎勃起功能。长期低氧可改变阴茎海绵体的结构和功能，甚至导致海绵体纤维化。可见，慢性低氧在器质性ED的发生中起非常重要的作用。但是，低氧能否导致CCSM细胞发生表型转化及其具体的分子机制目前尚不清楚。
　　血小板源性生长因子BB(PDGFBB)属于PDGF家族，是体内一种主要的促有丝分裂剂。在局部组织缺血缺氧、炎症等许多病理生理情况下，可由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞以及许多肿瘤细胞等多种细胞分泌。PDGFBB结合PDGF受体并使其磷酸化，活化下游重要的信号分子，参与多种信号转导通路如ras/GTP，PI3K，Src，MAPK等，在动脉粥样硬化及动脉再狭窄等心血管疾病中起非常重要的作用。PDGFBB能下调VSMC中myocardin的表达，使其发生表型转化。而我们前期研究表明，myocardin在CCSM细胞表型转化过程中也起关键作用，糖尿病性ED的大鼠阴茎海绵体中的myocardin明显下降，并且阴茎海绵体过表达myocardin能够逆转CCSM细胞的表型转化和改善糖尿病性ED大鼠的勃起功能。
　　综上所述，我们推想:PDGFBB下调myocardin可能在低氧诱导CCSM细胞发生表型转化的过程中起重要作用。尽管近年来，PDGFBB在心血管系统疾病方面被研究得比较深入，然而低氧能否促进CCSM细胞分泌PDGFBB，后者能否下调CCSM细胞中的myocardin表达水平并诱导其表型转化，目前尚不清楚。本研究分别通过在低氧条件下及重组PDGFBB刺激下培养CCSM细胞，观察低氧对CCSM细胞表型转化和CCSM细胞分泌PDGFBB的影响，以及PDGFBB对CCSM细胞表型转化及细胞中myocardin表达水平的影响，进而了解低氧诱导的CCSM细胞发生表型转化的重要分子机制，为勃起功能障碍的治疗提供理论基础。
　　方法：
　　1.大鼠CCSM细胞分离培养及细胞鉴定。
　　采用改良组织块培养法原代培养大鼠CCSM细胞，传代培养时进一步用差速贴壁法进行细胞纯化，从而筛选出高纯度的CCSM细胞，然后用平滑肌α肌动蛋白(α-SMA)和平滑肌细胞分化特异性抗原(smoothelin)细胞免疫荧光法鉴定细胞类型。
　　2.低氧对大鼠CCSM细胞表型转化及CCSM细胞分泌PDGFBB的影响。
　　取生物学性状相对较稳定的第二代CCSM细胞，将低氧组细胞置于2.5％氧浓度的低氧培养箱中培养24h和48h，而阴性对照组细胞置于正常氧浓度的5％CO2培养箱中培养24h和48h，分别收集24h和48h时实验组和对照组细胞及细胞培养上清液，利用qRT-PCR检测CCSM细胞中转录因子myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC和smoothelin的mRNA表达水平;用westernblotting检测CCSM细胞中转录因子myocardin的蛋白表达水平。用Elisa法检测CCSM细胞培养上清液中细胞因子PDGFBB的表达水平。
　　统计学分析
　　应用SPSS13.0统计软件分析，两组间差异的比较用两个独立样本t检验;多样本均数比较采用单因素方差分析，多个实验组和一个对照组的比较采用Dunnett法，组间多重比较采用LSD法。P＜0.05表示结果有统计学意义。
　　结果：
　　1.大鼠CCSM细胞分离培养及细胞免疫荧光鉴定结果。
　　倒置相差显微镜下观察发现，原代第4～5d时有少数梭形细胞从组织块边缘游出逐渐形成细胞晕，至22d左右细胞长满覆盖培养瓶底;传代并经差速贴壁离心法筛选后的细胞绝大部分呈梭形，呈方向性排列，少部分呈星形。生长密集时细胞呈典型的“峰-谷”样生长或者排列呈旋涡状。
　　CCSM细胞免疫荧光结果显示，荧光显微镜下观察发现，视野内细胞呈梭形或者星形，所有细胞核均呈现蓝色荧光，约97％细胞胞质呈现绿色荧光为α-SMA阳性，约96.5％的细胞胞质呈现为红色荧光为smoothelin阳性即CCSM细胞。
　　2.低氧可下调大鼠CCSM细胞中myocardin和收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC和smoothelin的表达水平。
　　荧光定量PCR检测结果显示，与阴性对照组比较，24h和48h时低氧组CCSM细胞中myocardin mRNA表达均显著下调（P均＜0.001）;α-SMA mRNA表达均明显下调（P均＜0.001）;SMMHC mRNA表达均明显下调(24h P＜0.001，48hP＜0.05); smoothelin mRNA表达均明显下调(24h P＜0.001，48h P＜0.01)。westernblotting检测结果显示，与阴性对照组相比，24h和48h时低氧组CCSM细胞中myocardin蛋白表达均减少（P均＜0.05）。可见，低氧能下调CCSM细胞转录因子myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC和smoothelin的表达，进而说明低氧可诱导CCSM细胞发生表型转化。
　　3.低氧能促进大鼠CCSM细胞分泌PDGFBB。
　　用Elisa法检测各组细胞培养上清液中细胞因子PDGFBB的含量，结果显示:与阴性对照组相比，24h和48h时低氧组CCSM细胞培养上清液中PDGFBB表达均明显增加（P均＜0.05）。
　　4.PDGFBB显著增强CCSM细胞增殖活性和迁移能力，PDGFBB作用于CCSM细胞的最适浓度为12.5ng/ml。
　　PDGFBB对CCSM细胞增殖活性的影响:分别采用终浓度为0、2.5、5.0、12.5及25.0ng/ml的重组PDGFBB刺激体外培养的大鼠CCSM细胞，24h和48h时用CCK-8法检测各组细胞增殖情况，结果（OD值）显示，在24h和48h时，与阴性对照组(0ng/ml PDGFBB)相比，各不同浓度的PDGFBB均能明显刺激大鼠CCSM细胞生长和增殖（各浓度24h和48h时P值均为P＜0.001）。且在终浓度为12.5ng/ml时，PDGFBB对CCSM细胞的促增殖作用最明显，由此我们筛选出PDGFBB作用于CCSM细胞的最适浓度为12.5ng/ml。
　　PDGFBB对CCSM细胞迁移能力的影响:利用细胞迁移实验，分别采用0ng/ml及12.5ng/ml的PDGFBB来诱导CCSM细胞迁移，结果显示，在12h和24h时，与阴性对照组相比，PDGFBB能明显增强CCSM细胞的迁移能力。
　　结论：
　　1.改良的组织块培养法和差速贴壁离心法可获得较纯的CCSM细胞。
　　2.低氧可诱导大鼠CCSM细胞发生表型转化。
　　3.低氧能促进大鼠CCSM细胞分泌PDGFBB。
　　4.PDGFBB显著增强CCSM细胞增殖活性和迁移能力;其最适终浓度为12.5ng/ml。
　　5.PDGFBB可促进CCSM细胞发生表型转化，其机制可能是通过下调myocardin来起作用的。
　　6.综合上述，我们得出:PDGFBB下调myocardin在低氧诱导的大鼠CCSM细胞表型转化中起重要作用。

目录

摘要

前言

第一章 低氧对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化和分泌PDGFBB的影响

1．实验材料

2．实验方法

3 结果和附图

第二章 PDGFBB下调myocardin在大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化中的作用

1．实验材料

2．实验方法

3 结果和附图

第三章 讨论

第四章 全文小结

参考文献

缩写词简表

硕士研究生期间发表论文情况

致谢

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