长远航作业人员颊粘膜和脐周微生物宏基因组学研究

摘要

背景和目的：
　　远海作业自古以来就成为人类获得资源、加强联系和对外防御的主要途径，但由于长远航作业的特殊性，船员的发病率高于陆地作业人员。人体口腔和体表与外界环境直接接触，是机体自身保护的第一道屏障，也是微生物的主要寄居部位。人体体表和口腔黏膜寄居着数百到数千种微生物，包括细菌，病毒，真菌等微生物种类，这些微生物具有特定的种类组成，即形成某种微生物生态系统。共生微生物与宿主共同在进化过程中保持动态平衡，共生微生物参与宿主的代谢和免疫过程，并且能够抵抗病原菌定植。大量的临床研究显示，微生物群落的变化与宿主疾病相关。海上特殊环境如狭小的舱室内空气不够流畅，气候潮湿闷热，清洁用的淡水补给不足等可能会引发体内和体表微生物群落的改变，影响机体的代谢、免疫功能从而在一定程度上影响作业能力。因此从微生物群落结构着手，分析长远航环境对体表和口腔微生物组成的影响，进一步利用微生物变化来评估人体健康状况，以预防疾病和维护健康。
　　宏基因组学(metagenomics)研究的对象是特定生物环境中全部微小生物的基因组，即所有生物遗传物质的总和，包含了可培养的和不可培养的微生物的基因。宏基因组学基于高通量DNA测序技术，并通过生物信息学方法对大规模测序结果分析了解微生物群落中的种群分布和功能基因，克服了传统微生物分析中绝大多数微生物难培养的障碍，可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了微生物资源的利用空间，成为目前研究微生物的新技术，广泛应用于环境微生物、人体口腔、皮肤及肠道微生物群落组成和功能研究。应用宏基因组学方法研究颊粘膜和脐周微生物种群结构和数量的变化，从不同层面分析了微生物群落组成、代谢功能及其对宿主健康状况的影响，认识了长远航环境对作业人员健康的影响，为长远航作业人员健康维护积累了科学数据。
　　材料和方法：
　　分别于长远航前后采集19人口腔颊粘膜和脐周微生物样本，提取微生物基因组DNA后进行测序研究。其中6人12例颊粘膜微生物样本应用Sanger法测序分析16S rRNA基因全长，12人48例颊粘膜和脐周微生物样本应用IlluminaMeseq测序平台对16S rRNA基因V4区段进行高通量测序分析，应用目前先进的后光学(post-light) DNA测序平台Ion-Torrent PGM系统及Illumina Miseq系统对1人共4例口腔颊粘膜和脐周微生物样本进行宏基因组测序分析;此外，采集此次长远航作业人员（57人）血液样本进行血常规血生化检测，应用临床常规检测方法检测不同批次长远航作业人员血清中叶酸(folate acid，FA)、同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)和维生素B12(vitamin B12，VB12)含量。Sanger法测序结果应用Genebank中BLAST程序与已知序列进行相似性分析，16S rRNA基因V4区段测序结果应用QIIME软件分析，宏基因组测序结果利用成熟的通用生物信息学分析软件MG-RAST3.3进行生物信息分析。应用SPSS19.0软件比较分析血常规血生化结果以及血清中叶酸、同型半胱氨酸和VB12含量。
　　结果：
　　16S rRNA和全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)结果证明长远航后期口腔颊粘膜微生物中在门水平以硬壁菌门(Firmicutes)为主，在属水平则以链球菌属(Streptococcus spp.)为主，符合研究报导，长远航后期硬壁菌门和链球菌属的含量进一步升高。比较分析长远航前后微生物组成和变化发现与前期相比后期微生物种类发生较大变化，前后两个时期的微生物趋向于分为两个类群，长远航后期微生物种类更加集中，结合16S rRNA和WGS多样性分析结果证明后期微生物多样性下降，比较微生物种类变化发现长远航后期致病菌和条件致病菌含量升高。应用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG)网站对微生物功能基因注释分析发现长远航后期微生物参与三大物质代谢和叶酸合成代谢的功能基因数量下降。分析血清中叶酸发现长远航后期血清叶酸水平下降，与微生物参与叶酸合成的酶类数量下降这一变化趋势正相关。长远航人员常规体检结果中粒细胞与淋巴细胞比值下降，平均血红蛋白浓度(mean corpuscular haemoglobin concentration，MCHC)下降，具有统计学意义。
　　长远航前期脐周微生物主要细菌菌门为变形菌门，后期含量下降而硬壁菌门含量升高成为主要菌门，细菌菌属分析结果证明前期葡萄球菌属和棒杆菌属占主导地位，长远航后期葡萄球菌属含量升高，棒杆菌属含量下降。多样性分析结果证明后期脐周微生物多样性下降，微生物组成及变化分析结果显示后期致病菌和条件致病菌含量升高。此外，KEGG分析结果证明后期微生物代谢活性下降，脐周微生物与颊粘膜微生物变化趋势一致。
　　结论：
　　长远航前后口腔颊粘膜微生物种类发生较大变化，长远航后期致病菌和条件致病菌含量升高，结合临床指标检查推测长远航作业环境影响颊粘膜微生物组成进一步影响作业人员颊粘膜及全身免疫功能。长远航后期微生物多样性下降推测海洋作业环境单一影响微生物保持多样性状态。此外，长远航后微生物叶酸合成活性变化与宿主血清叶酸水平具有正相关性，提示长远航作业中共生微生物可反映宿主健康状况。
　　长远航后期脐周微生物多样性下降、致病菌、条件致病菌含量升高及代谢活性下降，结合颊粘膜微生物检测结果推测长远航环境能够影响作业人员共生微生物，进而对机体健康造成影响。
　　主要创新点：
　　1.本研究运用目前先进的DNA二代测序技术Ion-Torrent和Illumina系统和先进的生物信息学分析软件MG-RAST进行分析，得到了更完整的颊粘膜及体表微生物种群的种类及分布信息。
　　2.分析发现长远航前后颊粘膜及体表微生物多样性下降、致病菌及条件致病菌含量升高以及微生物代谢功能降低，结合这些结果初步探讨了长远航环境对作业人员共生菌群的影响，为长远航过程中作业人员健康管理积累科学依据。
　　3.首次发现海上长远航不靠港连续作业三月以上，宿主血清叶酸代谢与其口腔颊粘膜共生物菌代谢趋势一致，即叶酸代谢通路受阻。海上长远航不定期靠港并给予作业者口服复合维生素和微量元素补充剂连续干预三月以上，观察到宿主血清叶酸代谢降低的趋势有所逆转。宿主血清叶酸含量、同型半胱氨酸含量，以及维生素B12浓度与岸基作业人员趋于一致。表明通过增加靠港补给、复合维生素和微量元素干预，长远航作业人员叶酸代谢受阻的现象得到改善。

目录

摘要

第一章 长远航作业人员颊粘膜微生物宏基因组学研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二章 长远航作业人员脐周微生物宏基因组学研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

缩略词简表

文献综述 人类肠道微生物组与相关疾病研究进展

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