二硫键异构酶对甲基苯丙胺诱导的α-突触核蛋白表达异常的机制研究

摘要

本研究拟建立METH中毒细胞模型，通过形态学、NOS含量、NO含量、凋亡、α-SN聚集及PDI的S亚硝基化等指标的检测，进一步验证METH引起中枢神经毒性作用。再通过NOS抑制剂(L-NNA)和NO供体(L-Arginine)验证氧化应激过程中PDI的变化，以及变化的PDI对异常表达的α-SN的影响，从而进一步完善METH诱导的α-SN异常表达的毒性机制，为治疗METH引起的毒性损伤提供理论基础。
　　目的:
　　建立METH中毒细胞模型，并给予NOS抑制剂和NO供体，通过形态学、NOS含量、NO含量、凋亡、α-SN聚集及PDI的S亚硝基化等指标的检测，从而研究METH诱导的氧化应激对PDI正常功能的影响，以及PDI在α-SN异常表达中所起的作用。再通过siRNA干扰技术反证之前所得的结果，以进一步明确METH、PDI以及α-SN这三者之间的联系，为METH神经毒性机制研究提供新的研究靶点。
　　方法:
　　1.METH中毒细胞模型的建立
　　(1)10％新生胎牛血清(FBS)的DMEM培养基分别接种PC12细胞至96孔板中，在37℃和5％CO2条件下培养，待细胞长至70％汇合时，分别用含0mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L、3mmol/LMETH的2％血清培养基培养24小时，CCK-8法检测细胞存活率变化。
　　(2)接种PC12细胞至10个6cm小皿中，待细胞长至70％汇合时，随机分成两组，其中一组的5个小皿用0.1 mmol/L L-NNA预处理30分钟，处理之后，两组的5个小皿的细胞分别用含0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/LMETH的2％血清培养基培养24小时，生物素转化法和western Blot分别检测各组细胞PDI-SNO表达变化，并综合比较以选取适宜浓度的METH以建立中毒细胞模型。
　　2.探究PDI对METH诱导的α-SN异常表达的作用机制
　　接种PC12细胞至6孔板或96孔板或10cm培养皿中并将细胞分为6组:空白对照组(CON)、空白NOS抑制剂组(CON+L-NNA)、空白NO供体组(CON+L-Arginine)、给药组(METH)、给药NOS抑制剂组(METH+L-NNA)、给药NO供体组(METH+L-Arginine)，24小时后，收集细胞或细胞液进行以下各项实验:
　　(1)倒置显微镜下观察各组细胞形态学损伤变化、CCK-8法观察各组细胞存活率的表达变化。
　　(2)TUNEL法和hoechst法检测各组细胞凋亡情况。
　　(3)酶化学法检测NOS、NO的活性变化，Western Blot法检测NOS表达情况。
　　(4)生物素转化法和Western Blot法检测各组细胞PDI-SNO表达变化。
　　(5)Western Blot法和免疫荧光法检测α-SN表达变化，并采用共聚焦显微镜观察细胞内α-SN形态变化。
　　3.PDI基因沉默的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内α-SN的表达情况
　　(1)针对PDI基因设计并合成三条siRNA干扰序列，采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞，采用Western Blot法检测出最有效的干扰序列。
　　(2)采用最有效的干扰序列沉默PC12细胞的PDI表达后，用METH和L-NNA共同处理，采用Western Blot法和免疫荧光法检测α-SN表达变化。
　　结果:
　　1.METH中毒细胞模型的建立
　　(1)以未经METH处理的PC12细胞为对照组，0.5～3mmol/L METH处理的PC12细胞存活率随METH浓度增加逐渐降低，除0.5 mmol/L处理组与对照组相比无显著性差异(p＞0.05)外，其他各浓度处理组与对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)。
　　(2)相比于空白对照组，METH处理的PC12细胞PDI-SNO表达随METH浓度增加逐渐增高，在METH浓度大于2 mmol/L时，PDI-SNO升高与对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)。当加入NOS抑制剂L-NNA时，可显著抑制METH引起的PDI-SNO表达升高，且当METH浓度为3mmol/L时，抑制效果最为显著(p＜0.01)，故在后期试验中，选取3mmol/L浓度的METH建立中毒细胞模型。
　　2.探究PDI对METH诱导的α-SN异常表达的作用机制
　　(1)六组细胞模型分别经过不同的处理24h后，倒置显微镜下观察各组细胞形态变化，可见CON+L-NNA组细胞形态与CON组相比无明显变化，而CON+L-Arginine组和METH组细胞形态与CON组相比明显改变，可见胞体皱缩变圆，变圆细胞的胞质透亮度增加可见环形透亮区，且突起变短、断裂、甚至消失，并可见细胞脱壁漂浮，METH+L-NNA组与METH组相比，细胞形态改变有明显的改善，而METH+L-Arginine组与METH组相比，细胞形态改变更为显著。CCK-8法测得CON+L-NNA组细胞存活率较CON组无明显变化(P＞0.05)，CON+L-Arginine组和METH组细胞存活率较CON组显著下降(p＜0.05)，METH+L-NNA组细胞存活率较METH组显著升高(p＜0.05)，METH+L-Arginine组细胞存活率较METH组显著下降(p＜0.05)。
　　(2)采用TUNEL法和hoechst法检测6组细胞凋亡情况发现:CON+L-NNA组细胞凋亡较CON组无明显变化(P＞0.05)，CON+L-Arginine组和METH组细胞凋亡较CON组显著下降(p＜0.05)，METH+L-NNA组细胞凋亡较METH组显著升高(p＜0.05)，METH+L-Arginine组细胞凋亡较METH组显著下降(p＜0.05)。
　　(3)酶化学法检测发现:CON+L-NNA组细胞内NOS和NO活性较CON组无明显变化(P＞0.05)，CON+L-Arginine组和METH组细胞内NOS和NO活性较CON组显著升高(p＜0.05)，METH+L-NNA组细胞内NOS和NO活性较METH组显著降低(p＜0.05)，METH+L-Arginine组细胞内NOS和NO活性较METH组显著升高(p＜0.05)。且通过Western Blot法检测细胞内NOS表达，结果与酶化学法检测结果一致。
　　(4)生物素转化法和Western Blot法检测各组细胞PDI-SNO表达发现:METH和L-Arginine可使PDI发生显著的S亚硝基化，使得PDI-SNO表达显著升高(p＜0.05)，而L-NNA可有效抑制METH引起的PDI的S亚硝基化，L-Arginine则显著加剧METH引起的PDI的S亚硝基化。
　　(5)Western Blot法检测各组细胞α-SN表达发现:CON+L-Arginine组和METH组细胞内α-SN相比于CON组显著升高(p＜0.05)，而METH+L-NNA组细胞内α-SN相比于METH组显著降低(p＜0.05)，METH+L-Arginine组细胞内α-SN相比于METH组显著升高(p＜0.05)。在共聚焦显微镜下观察可见:CON+L-Arginine组和METH组细胞内α-SN发生显著聚集，L-NNA可有效抑制METH引起的α-SN的聚集，L-Arginine则显著加剧METH引起的α-SN的聚集。
　　3.PDI基因沉默的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内α-SN的表达情况
　　(1)针对PDI基因设计并合成三条siRNA干扰序列，采用RNA干扰技术(RNAi)处理PC12细胞，采用Western Blot法检测出最有效的干扰序列。结果显示三条siRNA序列都能够沉默PDI基因的表达，其中第二条序列沉默效果最好。
　　(2)采用最有效的干扰序列沉默PC12细胞的PDI基因表达后，再用METH和L-NNA共同处理细胞24h，Western Blot法检测发现PDI沉默后的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下，L-NNA无法有效的抑制METH引起的α-SN的异常表达，且在共聚焦显微镜下观察的结果也与前者一致，α-SN的聚集无法得到显著抑制。
　　结论:
　　1.PDI-SNO在METH处理的PC12细胞株中表达显著上调，且上调趋势随METH浓度的增高而升高。NOS抑制剂L-NNA可有效抑制PDI-SNO的表达，且当METH的浓度为3mmol/L时，抑制效果最为显著。
　　2.METH可诱导细胞产生氧化应激及细胞内α-SN发生聚集，氧化应激使得PDI发生S亚硝基化而无法抑制α-SN的聚集，聚集的α-SN使得细胞毒性增强，促进细胞凋亡。NOS抑制剂L-NNA可有效抑制这一过程从而抑制METH的神经毒性，而NO供体L-Arginine则作用相反。说明氧化应激使得PDI功能异常，进而无法通过抑制α-SN的聚集起到神经保护作用。
　　3.PDI基因沉默的PC12细胞即使加入NOS抑制剂L-NNA，也无法抑制METH导致α-SN的聚集。说明PDI是抑制α-SN聚集的关键分子。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 METH中毒细胞模型的建立

1 材料与方法

1．1 材料和试剂

1．2 方法

2 结果

2．1 不同浓度的METH处理，各组细胞存活率的变化

2．2 L-NNA和不同浓度的METH共同处理，细胞内PDI-SNO表达情况

3 讨论

参考文献

第二章 探究PDI对METH诱导的α-SN表达异常的作用机制

1 材料与方法

1．1 材料和试剂

1．2 方法

2 结果

2．1 各组细胞形态学变化

2．2 各组细胞存活率的变化

2．3 各组细胞凋亡率的变化

2．4 各组细胞NO含量变化

2．5 各组细胞NOS活性变化

2．6 各组细胞PDI-SNO含量变化

2．7 各组细胞α-SN含量变化

2．8 各组细胞α-SN形态变化

3 讨论

参考文献

第三章 PDI基因沉默的PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内α-SN的表达情况

1 材料与方法

1．1 材料和试剂

1．2 方法

2．结果

2．1 质粒转染结果

2．2 PDI基因沉默后PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内α-SN含量变化

2．3 PDI基因沉默后PC12细胞在METH和L-NNA共同处理下细胞内α-SN形态变化

3 讨论

参考文献

全文小结

英文缩略词注释

攻读硕士学位期间成果

致谢

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