慢性移植物抗宿主病小鼠模型的建立及鉴定

摘要

移植物抗宿主病(GVHD)是发病率和病死率均高的异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后并发症。
　　慢性移植物抗宿主病(cGVHD)为allo-HSCT后的远期并发症，有着发生率高、生存率低、严重影响患者生存质量等特点。cGVHD复杂的发病机制尚未被充分了解，因此建立cGVHD动物模型以深入探索cGVHD显得很有必要。
　　目前国际上最常用的cGVHD动物模型为小鼠模型。根据模型表现和构建方法的差异，可以将模型分为四类:硬皮病样cGVHD小鼠模型，狼疮样cGVHD小鼠模型，狼疮-硬皮病样cGVHD小鼠模型和胸腺功能缺陷导致的cGVHD小鼠模型。这几种模型并不是互相独立的，但也各有特点。本文所拟建立的硬皮病样cGVHD小鼠模型应用广泛，其特点为以类似于人类硬皮病的皮肤纤维化为特征，可累及肝、肺、唾液腺等器官，而以这类表现为主的cGVHD可出现在多达10％-15％的患者中。此模型的分子病理学基础为主要组织相容性复合体(MHC)相合而有众多的次要组织相容性抗原(miHA)不合。建立本模型的受鼠多需要接受致死剂量的全身放射(TBI)，国外的范例之一为以B10.D2.为供鼠，以BALB/c为受鼠。
　　T细胞被认为参与了cGVHD的形成和加重的全程。如果单纯输注供鼠的骨髓细胞(BMC)（几乎不含T细胞）给受鼠，则不能发生cGVHD。因此，在建立cGVHD模型的过程中，一般会将供鼠来源的骨髓细胞与含有较高比例T细胞的脾细胞(SpC)混合后一起回输给受鼠，从而诱发受鼠的cGVHD。改变脾细胞输注量可能会影响移植物中T细胞的比例，从而影响cGVHD进程。而骨髓细胞中含有的间充质干细胞和髓源抑制细胞等免疫抑制性细胞被逐渐发现，提示了骨髓输注可能会对cGVHD的进程有免疫抑制的效果。尽管有较多的构建cGVHD小鼠模型的方案，但在构建小鼠cGVHD模型中，还没有关于改动骨髓与脾细胞输注比例是否会对移植成功率和模型稳定性产生影响的研究。
　　CD4+T细胞中有功能相异的两大亚群—Th1细胞和Th2细胞。一些研究认为，Th1细胞主导了急性移植物抗宿主病（aGVHD），并且可能因分泌IFN-gamma、 IL-2、IL-12等而诱发了细胞因子风暴，从而激活Th2细胞，通过IL-4、IL-5、IL-10等的作用，导致cGVHD的发生。研究表明Th1细胞相关的细胞因子通常在cGVHD时期表达较低，而同时Th2细胞相关的细胞因子却在cGVHD进程中发挥着重要的作用，并有可能因此抑制了Th1、Th17等细胞的增殖和相关细胞因子的分泌，因为Th1和Th2细胞及其相关细胞因子之间通常呈拮抗作用。同时，IL-4、IL-5、IL-13等部分Th2细胞相关细胞因子被证明能够刺激纤维母细胞增殖，促进胶原沉积，这些特性被证明与硬皮病样cGVHD小鼠模型的特征性纤维化有着直接的关系。尽管Th1细胞主导的GVHD也能有同样甚至更加猛烈的炎症反应，但是Th1细胞分泌的细胞因子并不能使纤维母细胞增生并促进胶原的沉积，说明了上述纤维化表现只是由于受到Th2及其相关细胞因子的作用，而与Th1及其细胞因子无关。
　　目的:
　　建立一种能良好地模拟人类cGVHD的小鼠cGVHD模型，鉴定这种模型的临床表现、病理学特征。在建立模型的过程中，了解骨髓细胞和脾细胞输注量的改变对建模成功率和模型建成后较长时间内cGVHD严重程度和稳定性的影响，进而摸索得出建立这个小鼠cGVHD模型的理想骨髓细胞和脾细胞输注量。
　　模型的建立过程中，本文将探索模型随时间进程而改变的病理学表现和Th细胞相关细胞因子变化情况，鉴定本模型发生发展的分子学机制，探讨其在模拟人类cGVHD过程中的意义。
　　方法:
　　1.将8-10周龄的雌性BALB/c小鼠(H-2d)随机分为以下几组作为受鼠，每组的脾细胞输注量和骨髓细胞输注量均有所不同:
　　a)A组（骨髓细胞∶脾细胞=8∶9＜1）:TBI后尾静脉输注骨髓细胞8×106，脾细胞9×106(n=20);
　　b)B组（骨髓细胞∶脾细胞=6∶9＜1）:TBI后尾静脉输注骨髓细胞6×106，脾细胞9×106(n=5);
　　c)C组（骨髓细胞∶脾细胞=8∶8=1）:TBI后尾静脉输注骨髓细胞8×106，脾细胞8×106(n=5);
　　d)D组（骨髓细胞∶脾细胞=6∶8＜1）:TBI后尾静脉输注骨髓细胞6×106，脾细胞8×106(n=5);
　　e)E组:TBI后尾静脉输注骨髓细胞8×106(n=5);
　　f)F组:TBI后无任何处理(n=5);
　　g)G组:无任何处理(n=5)。
　　在给受鼠做好移植前肠道准备（红霉素250毫克/升，庆大霉素32万单位/升，移植前7天开始并维持至移植后14天）的基础上，取同样8-10周龄的雄性B10.D2.(Hc1 H-2d H2-T18c)小鼠作为供鼠，获取供鼠的BMC和SpC并根据上述分组调整至事宜浓度，在受鼠接受完源皮距为100 cm，30 cm×30 cm照射野，700 cGy，698跳，TBI处理后的4小时，经由小鼠尾静脉回输给受鼠（F组TBI后不回输细胞，G组不处理）。
　　2.每日观察小鼠，移植后前14天监测小鼠白细胞计数以判断植入是否成功，第14天开始按照临床观察评分表给小鼠评cGVHD分值并记录，至少每3天的固定时刻评分一次。
　　3.设置移植后第15天、第25天、第35天、第45天、第55天、第65天、第75天作为观察点集中评价cGVHD临床评分，第75天后处死所有小鼠(A组处死5只)。A组小鼠另外设置移植后第15天、第25天、第35天、第95天作为观察点，每个观察点处死3只小鼠并留取外周血血清，用LUMINEX试剂盒检测Th细胞亚群相关的细胞因子水平。所有死亡或处死小鼠均留取组织病理标本。
　　4.病理标本制作HE染色切片，并在镜下根据cGVHD的病理评分标准评价cGVHD评分，超过2分才能视为发生了cGVHD。
　　5.分析不同组的临床cGVHD评分和cGVHD病理改变;分析不同观察时间点的cGVHD病理改变和细胞因子水平变化。
　　结果:
　　1.移植后第8天，所有存活小鼠的白细胞计数皆大于1×109/L，A、C、E、G组小鼠存活100％，B、D组小鼠存活80％，F组全部死亡，死亡小鼠的死因是造血功能衰竭。第75天的A、B、C、D组的病理学结果表明这几组中的所有小鼠（除前14天死亡的小鼠以外）均有cGVHD。A、C组小鼠的移植成功率优于B组和D组(P＜0.05)。
　　2.A组（骨髓细胞∶脾细胞=8∶9＜1）、B组（骨髓细胞∶脾细胞=6∶9＜1）、D组（骨髓细胞∶脾细胞=6∶8＜1）小鼠的cGVHD评分较高而稳定，C组（骨髓细胞∶脾细胞=8∶8=1）小鼠的cGVHD评分从移植后第50天开始逐渐降低，即不能维持较强的cGVHD临床表现。其评分在移植后第55天、第65天和第75天较其他组低(P＜0.05)，在移植后第25天和第35天较A组低(P＜0.05)。C组的病理学改变较其他组轻(P＜0.05)，尤其是皮肤的表现较为明显。
　　3.本模型的临床表现以体重减轻，消瘦，脱毛，尾爪部肿胀、硬化、脱皮、结痂和溃疡，排稀便，气促和弓背等为主。A组小鼠移植后第15天的病理学改变中皮肤以炎性细胞浸润为主，肺部有少许炎症细胞浸润;移植后第25天表现为皮肤以脂肪减少和炎性细胞浸润为主，肺部结构完好而炎症细胞浸润增加;移植后第35天表现为皮肤出现胶原纤维增生，伴有脂肪层萎缩和炎性细胞浸润，肺部表现为基本肺结构遭破坏，伴肺间质大量炎症细胞浸润;移植后第95天表现为皮肤胶原纤维增生明显，毛囊大幅减少伴炎症细胞浸润，肺部基本肺结构大片消失伴肺间质纤维化和炎症细胞浸润。第95天的cGVHD病理评分高于第15天、第25天、第35天时的cGVHD病理评分(P＜0.05)。
　　4.IFN-gamma(P＜0.05)、IL-1beta(P＜0.05)、IL-2、IL-17A等Th1、Th17相关的细胞因子在第15天后含量下降，GM-CSF、IL-12p70等Th1、Th17相关的细胞因子在cGVHD进程中变化不明显。而IL-4、IL-5(P＜0.05)等Th2细胞相关的细胞因子随cGVHD进展而含量升高(P＜0.05)。
　　结论:
　　成功建立了小鼠cGVHD模型B10.D2.(Hc1 H-2d H2-T18c)→BALB/c(H-2d)。本模型以纤维化所致的表现为主，主要累及皮肤和肺，也累及消化道等器官。模型在移植后第8天恢复造血，cGVHD进程中靶器官受损由早期的炎症细胞浸润为主向胶原沉积为主转变。
　　本模型cGVHD严重程度与骨髓细胞和脾细胞的比例有关，当骨髓细胞:脾细胞的比例小于1时，可以获得稳定、持续且较严重的cGVHD小鼠模型。而当骨髓细胞:脾细胞=1时，所得到的小鼠cGVHD模型疾病表现相对较弱。
　　本研究结果推荐在建模时给每只受鼠回输8×106骨髓细胞及9×106脾细胞。这能在提高建模成功率的同时，保证维持cGVHD强度。
　　本模型是以Th2细胞相关的细胞因子为主导的，以组织器官纤维化为特征的小鼠cGVHD模型，并能较好模拟部分临床cGVHD进程和细胞因子表达情况。

目录

摘要

第一章 前言

第一节 慢性移植物抗宿主病

第二节 慢性移植物抗宿主病小鼠模型

第二章 材料和方法

第一节 动物来源和动物实验场地

第二节 主要试剂和耗材

第三节 实验方法

第四节 统计学分析

第三章 实验结果

第一节 脾细胞和骨髓细胞输注量的变化对本模型中小鼠cGVHD严重程度的影响

第二节 A组小鼠移植后不同时间点cGVHD病理学改变

第三节 T细胞亚群相关细胞因子在cGVHD进程中的改变

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

附录

成果

致谢

声明