基因转录激活子MeCP2和Rb调控环沉默在氢醌诱发细胞恶变过程中的作用及表观遗传学机制

摘要

研究背景:
　　DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学修饰(epigenetic modification)在基因转录调节过程起着重要作用，是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件，是近年来生命科学的热门研究领域之一，其中DNA甲基化是研究得最为广泛的表观遗传学修饰。
　　MeCP2(methyl-CpG binding protein2)是MBD家族最重要的成员之一，也是潜在的肿瘤临床治疗靶点。大量研究表明，MeCP2是一个多功能基因，而这些功能绝大多数是通过对其他基因的转录调节而实现的。
　　苯是一种常见的环境污染物和重要的工业溶剂，是一种全球用量极大的环境致癌物，其过量暴露和急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）发病风险升高有关。氢醌（hydroquinone，HQ）是苯的重要代谢产物，是一种具有血液毒性的毒物，长期、过量暴露于HQ能引起贫血、白血病等血液疾病，由于不需活化即有生物学活性，是苯的常用体外研究替代物。MeCP2表达异常在各种肿瘤组织和细胞中非常常见，且普遍为高表达。国内外而关于毒物对MeCP2表达的影响研究非常少。我们前期研究发现，MeCP2表达在HQ处理细胞、HQ诱导恶性转化细胞中呈现出动态变化，且Rb表达与MeCP2的表达在不同时间点的相关关系一直保持不变，提示Rb很有可能受MeCP2的正性调节。
　　Rb基因(retinoblastoma gene)是肿瘤临床治疗靶点，Rb的功能涉及细胞凋亡和衰老、细胞增殖、细胞周期、应对DNA损伤和维持基因组稳定，同时研究表明，Rb表达异常在肿瘤的发生发展过程也起非常重要的作用，但其异常表达的机制尚不清晰。
　　综上，前期研究结果、生物信息学分析结果和前人关于Rb和MeCP2功能研究结果，我们提出假设:HQ诱发的癌变过程中，MeCP2与Rb之间很可能存在正调控环，该调控环使MeCP2和Rb在HQ诱导的癌变进程中，表达量越来越低以致其沉默，其中表观遗传学改变在此过程发挥重要作用。为证实该假设开展了本研究。
　　研究方法:
　　1.细胞及HQ剂量选择
　　使用TK6淋巴母细胞进行本研究，遵循两个原则:(1)细胞染毒后能观察到HQ对细胞有一定的毒性，但细胞活力不能小于75％;(2)我国涉苯行业苯的实际接触水平。
　　2.细胞生物学性状检测
　　以细胞计数法和CCK-8试剂盒检测恶性转化细胞的生长速度。细胞固定后，以PI标记，用流式细胞术检测细胞周期分布情况。使用PI和FITC的双标记法进行细胞标记，流式细胞术对细胞的凋亡情况进行分析。
　　3.化学物处理
　　使用DNMT甲基转移酶抑制剂(5-AZA)、组蛋白乙酰化酶抑制剂(TSA)或DNA损伤诱导剂DOX处理细胞，24 h后收集细胞并进行相关检测。
　　4.基因表达水平检测
　　使用TRIzol试剂提取细胞RNA，进行反转录，用SYBR Green定量RT-PCR检测细胞mRNA表达水平。使用细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，Western blotting检测相关蛋白表达水平。细胞用甲醇固定后，使用间接免疫荧光流式细胞术检测Rb和MeCP2蛋白表达。
　　5.甲基化特异性PCR检测基因启动子DNA甲基化水平
　　在UCSC数据库调取基因启动子DNA序列，使用methyl primer express甲基化特异性PCR引物设计软件设计引物。使用试剂盒提取细胞基因组DNA后，使用基因组DNA进行CpG修饰。使用PCR方法检测启动子区DNA甲基化水平。
　　6.生物信息学分析
　　从UCSC调取Rb启动子区DNA序列，查阅相关文献并使用consite等软件预测MeCP2结合位点。
　　7.染色质免疫共沉淀（ChIP）检测启动子区蛋白结合情况
　　设计PCR引物，细胞使用1％甲醛交联后，提取细胞核，超声和核酶处理细胞核。使用chip级别抗体进行染色质沉淀，对染色质进行纯化，使用实时荧光定量PCR方法对沉淀染色质含量进行检查。
　　8.慢病毒MeCP2表达载体构建及稳定表达细胞构建
　　使用基因克隆的方法将MeCP2的CDS克隆至Plvx-puro真核表达载体，使用慢病毒进行包装并感染细胞，感染后的细胞使用嘌呤霉素进行筛选，获得稳定表达细胞后用Western blotting对MeCP2表达量进行鉴定。
　　9.Co-IP检测MeCP2/Rb蛋白复合体
　　RIPA裂解液裂解细胞后，调整蛋白浓度使每个样品蛋白浓度一致，按500μg/μg抗体加入抗体，4℃摇床过夜，加入琼脂糖珠，4℃摇床1h，收集上清，使用细胞裂解液洗涤3次，加入SDS上样缓冲液，沸水浴变性5min，进行westernblotting检测。
　　研究结果
　　1.染毒剂量的选择
　　HQ剂量选择遵循以下两个原则:(1)细胞染毒后能观察到HQ对细胞有一定的毒性，但细胞活力不能小于75％;(2)我国涉苯行业苯的实际接触水平。因此HQ剂量选择为0～20.0μmol/L。
　　2.恶性转化细胞生长速度检测结果表明，HQ处理细胞已经初步具有肿瘤恶性特征。
　　3.恶性转化细胞周期和凋亡改变
　　恶性转化细胞S期细胞比例比正常细胞增多，由正常细胞的41.1％上升为48.2％，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.RB、PTEN、p53、TPOR、H-RAS和miR-223在恶性转化细胞中的表达
　　RT-PCR方法检测Rb、PTEN、p53、TPOR和H-RAS五个基因的mRNA及miR-223的表达水平，与正常细胞相比，Rb和PTEN的mRNA表达量在恶性转化细胞中的表达水平下降，分别是正常细胞的0.61和0.49倍，而TPOR、H-RAS和miR-223的表达水上升，分别为为正常细胞的1.91、1.73和2.36倍，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而p53基因mRNA表达量无明显改变。western blotting结果显示，Rb、PTEN、TPOR和H-RAS基因的表达水平与RT-PCR的结果相一致，但是P53蛋白的表达量比正常细胞低。
　　5.TSA和5-AZA处理对恶性转化细胞Rb和TPOR表达水平的影响
　　DNMT抑制剂5-AZA和去乙酰化酶（HDAC）抑制剂TSA处理恶性转化细胞，5-AZA可使Rb基因的mRNA表达水平恢复至正常，对p53和PTEN基因的mRNA表达没有影响，然而可使TPOR的mRNA表达水平较恶性转化细胞的上升得更高。
　　6.TSA和5-AZA处理对恶性转化细胞生物学性状的影响
　　5-AZA和TSA处理均可降低恶性转化细胞的细胞活力，其细胞活力分别是未处理组的49.1％和43.1％，差异有统计学意义（P＜0.05），同时细胞周期阻滞于G1期，5-AZA和TSA处理细胞G1比例分别由对照组的37.5％上升到60.8％(P＜0.05)和70.3％(P＜0.05)，细胞凋亡率也显著提高，分别由对照组的10.4％上升到23.8％(P＜0.05)和15.1％(P＜0.05)。
　　7.RB、DNMTs、MBDs在HQ处理细胞和HQ恶性转化细胞中的动态表达
　　只有MeCP2表达趋势和Rb的表达趋势保持一致，为正相关关系。
　　8.MeCP2调节Rb生物信息学预测
　　经分析在Rb启动子区有两个CpG岛，在CpG岛内有25个MeCP2特异性结合位点，两个MBD2结合位点。
　　9.Rb启动子区DNA甲基化及MECP2结合情况检测
　　提取用HQ处理5w并脱离处理10天的细胞DNA进行MSP检测，结果表明，Rb启动子区DNA甲基化程度先随着HQ剂量的增加而降低，而后又上升。
　　10.TSA和5-AZA处理对MeCP2和MBD2表达水平的影响
　　5-AZA和TSA处理能恢复HQ恶性转化细胞的MeCP2表达水平，与HQ恶性转化细胞相比，表达水平上升，而MBD2的表达水平经TSA处理后下降，5-AZA处理无显著性影响。
　　11.Rb蛋白与MeCP2蛋白形成蛋白复合体
　　CO-IP结果表明，Rb蛋白和MeCP2蛋白之间能形成蛋白复合体。
　　12.MeCP2基因恢复对恶性转化细胞Rb基因表达的恢复
　　与GFP空载体细胞相比，MeCP2表达载体细胞的MeCP2的mRNA表达水平上升6.25倍，western blotting检测结果得到一致的结果。Rb的表达水平和MeCP2的相一致，表明MeCP2能激活Rb表达。
　　13.Rb调控MeCP2基因表达
　　DOX处理可激活恶性转化细胞Rb蛋白的表达，同时伴有MeCP2蛋白表达的上升。
　　结论:
　　1.DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD1和MBD2在HQ处理的TK6细胞及其恶性转化细胞中的表达出现异常，TPOR、H-RAS、PTEN、p53和miR-223在恶性转化细胞中的表达也出现异常。
　　2.Rb和MeCP2表达在恶性转化细胞中的表达为下调，在HQ处理的非恶性转化细胞中的表达为上调，二者的表达始终保持相同趋势。
　　3.MeCP2和Rb之间存在正调控环，该调控环的沉默在HQ诱发的肿瘤发生过程发挥重要的生物学作用。
　　4.表观遗传学机制在HQ介导的MeCP2/Rb正调控环沉默过程中发挥重要作用。

目录

摘要

一、前言

二、材料

一、细胞系、菌种、质粒、动物和实验耗材

二、主要试剂

三、主要溶液配制

四、主要仪器

三、方法

一、细胞培养与传代

二、细胞总RNA的提取、定量、完整性鉴定和纯度分析

三、实时荧光定量PCR检测mRNA表达量(RT-PCR)

四、细胞周期检测

五、细胞凋亡检测

六、细胞总蛋白提取和浓度测定

七、Western blotting检测蛋白表达量

八、免疫流式细胞检测蛋白含量

九、免疫共沉淀(CO-IP)

十、染色质免疫共沉淀(CHIP)

十一、甲基化特异性PCR(Methyl-specific PCR，MSP)检测Rb启动子甲基化水平

十二、MeCP2基因恢复表达细胞的构建

十三、裸鼠体外成瘤实验

十四、统计学分析

四、研究结果

第一部分 氢醌诱导TK6细胞恶性转化模型的建立及其生物学性状研究

1．染毒剂量的选择

2．恶性转化细胞生长速度检测

3．恶性转化细胞细胞周期和细胞凋亡改变

4．裸鼠体外成瘤实验鉴定恶性转化细胞

5．肿瘤相关基因在恶性转化细胞中的表达

第二部分 HQ诱导Rb基因表达异常的分子机制研究

1．5-AZA和TSA处理影响恶性转化细胞Rb、TPOR和miR-223表达水平

2．5-AZA和TSA处理对恶性转化细胞生物学性状的影响

3．RB、DNMTs、MBDs在HQ处理细胞及HQ恶性转化细胞中的动态表达

4．MeCP2调节Rb生物信息学分析

5．Rb启动子区DNA甲基化程度检测

6．Rb启动子区MeCP2结合情况检测

7．5-AZA和TSA处理提高MeCP2表达水平

8．5-AZA和TSA处理对HQ诱导恶性转化细胞MBD2表达的影响

9．Rb／MeCP2蛋白复合体检测

10．MeCP2基因恢复对恶性转化细胞Rb基因表达的恢复

11．Rb调控MeCP2基因表达

五、讨论

参考文献

综述 甲基CpG结合蛋白的基因转录功能研究进展

博士期间发表的主要论文

致谢

声明

统计学审稿证明