雷帕霉素在兔眼滤过性手术中抗瘢痕作用的实验研究

摘要

背景:
　　青光眼作为一种眼科常见病，已成为导致人类失明的主要眼病之一。其主要特征为眼压升高使得视神经损害。单纯采用药物治疗很难控制眼压，因而青光眼滤过性手术便成为了控制眼压的重要方法。尽管现在青光眼手术已经取得了很大的进步，但是此类手术两年失败率仍然高达20％左右。这其中的主要原因就是滤过道形成瘢痕，滤过泡不能很好行使自身功能。因而，如何有效的减少滤过性手术后瘢痕的形成就成为现在眼科研究的热点和难点。
　　尽管有很多抗瘢痕药物已经面市，并且已经取得了一些效果，如提升滤过泡功能、提高手术的成功率。但是，这些药物的使用也带来了一系列的并发症和副作用，如低眼压，因而使得这些药物很难进入临床应用。于是选择疗效好、并发症和毒副作用小的抗瘢痕药物就显得尤为重要。
　　作为一种大环内酯类抗生素，雷帕霉素首先是作为免疫抑制药物进行使用的。目前，国内外的很多研究学者已经将其应用于瘢痕的研究中，但其抗瘢痕的作用机理尚未完全阐明。本课题主要研究雷帕霉素在兔眼滤过术后抗瘢痕形成过程中的作用，为其应用于临床提供一定的理论根据。
　　目的:
　　本实验研究就是通过术后眼压、眼部反应、滤过泡形态观察、组织病理和细胞增殖敏感性指标——PCNA（抗增殖细胞核抗原）和α-SMA（平滑肌肌动蛋白抗体）的比较，评价雷帕霉素在兔眼滤过术后抗瘢痕形成的作用和眼毒性，为其应用于临床，提高手术成功率提供一定的理论依据。并通过检测不同浓度雷帕霉素对RTFs细胞的凋亡诱导作用来说明雷帕霉素的抗瘢痕作用。
　　方法:
　　取健康成年的青紫兰兔96只，雌雄不限，体重2.0-2.5Kg，测量基础眼压后左眼行小梁切除术，术后随机分为四组，三组实验组和一组对照组，每组24只。术后实验组左眼分别滴1％、3％、5％浓度的雷帕霉素，对照组左眼滴药用蓖麻油，4次/天，连续用药7天。术后分别于第7天、14天、21天、28天用Schiotz眼压计测眼压，测量三次取平均值。术后每日在裂隙灯下观察结膜充血、角膜透明度、前房反应及晶状体透明度。依照Krofeld分型法比较滤过泡形态和功能。分别于术后第7、14、21、28天每组随机各取6只灰兔处死后，分离眼周组织，完整取下眼球，放入中性甲醛中固定。取手术区全部组织经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡、包埋，作连续切片，待树胶干燥后，常规HE染色，光镜观察，免疫组化方法标记PCNA和α-SMA。经SPSS13.0统计软件进行检验，P＜0.05作为显著性标准，得出结果。
　　将RTFs进行体外培养，并用免疫荧光法鉴定观察成纤维细胞。采用Hoechst染色方法检测不同浓度(0mg/L、0.06mg/L、0.25mg/L、1mg/L、4mg/L)的雷帕霉素对于RTFs细胞是否存在诱导凋亡作用。采用MTT法检测不同浓度的雷帕(0mg/L、0.06mg/L、0.25mg/L、1mg/L、4mg/L)霉素处理后的成纤维细胞的OD值之间的差异，并加入广谱caspase阻断剂进行对照，分析雷帕霉素的作用机制。采用Real-time PCR和Western blot方法检测不同浓度雷帕霉素处理成纤维细胞后caspase-3，-8，-9的表达变化，之后检测采用最优浓度的雷帕霉素处理细胞后caspase-3，-8，-9表达的改变。
　　结果:
　　1.分别给予实验组1％雷帕霉素、3％雷帕霉素和5％雷帕霉素，对照组给予药用蓖麻油处理后，测量眼压在各个时间点(第7天(F=240.379，P＜0.001)、第14天(F=127.221，P＜0.001)、第21天(F=56.036，P＜0.001)、第28天(F=85.413，P＜0.001))四组间均具有显著性差异。三个实验组眼压均比对照组要低(P＜0.05)，且各实验组之间的两两比较也具有显著性差异。
　　2.实验组与对照组均表现有轻微的结膜充血和前房闪辉，未见炎性细胞(0-1分)，于术后7天基本消失且四组无显著差别，未见角膜水肿和晶状体混浊。
　　3.手术后28天时，对照组的滤过泡形成率降为0，而实验组1％雷帕霉素的滤过泡形成率为33.33％，3％雷帕霉素的滤过泡形成率为50％，5％雷帕霉素的滤过泡形成率为66.67％。各实验组功能性滤过泡形成率在手术后7天、14天、21天均比对照组要高(P＜0.05)，并且随着雷帕霉素的浓度的升高，功能性滤过泡形成率会呈现上升的趋势。
　　4.手术后第7天、14天、21天，各实验组的PCNA阳性成纤维细胞数均比对照组的PCNA阳性成纤维细胞数要少，且具有显著性差异(P＜0.05)，而且随着术后时间的延长，PCNA阳性成纤维细胞数都呈现降低趋势。换句话说对照组的PCNA阳性成纤维细胞数比实验组的PCNA阳性成纤维细胞数要高，说明对照组的成纤维细胞增殖程度高于实验组，因而对照组的瘢痕化程度显著高于实验组，也就是说雷帕霉素能够很好地起到抗瘢痕作用。
　　5.手术后第7天、14天、21天，各实验组的α-SMA阳性成纤维细胞数均比对照组的α-SMA阳性成纤维细胞数要少，且具有显著性差异(P＜0.05)，而且随着术后时间的延长，α-SMA成纤维阳性细胞数都呈现降低趋势。换句话说对照组的α-SMA阳性成纤维细胞数比实验组的α-SMA阳性成纤维细胞数要高，说明对照组的成纤维细胞增殖程度高于实验组，因而对照组的瘢痕化程度显著高于实验组，也就是说雷帕霉素能够很好地起到抗瘢痕作用。
　　6.分别统计出各实验组与对照组眼压值，功能性滤过泡数，PCNA和α-SMA阳性成纤维细胞数量，经SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和卡方检验，P＜0.05作为显著性标准。
　　7.病理切片标本由专人进行光镜组织学检查。PCNA染色片观察棕黄色颗粒位于细胞核，显著高于背景为染色成功;α-SMA染色片观察胞浆呈棕色染色，显著高于背景为染色成功。PCNA和α-SMA阳性成纤维细胞定量分析，使用计数器计算滤过区内单位面积（每平方微米）的阳性成纤维细胞总数。每张切片在显微镜下(×400)随机选择5个镜视野，数出每个视野所含的PCNA和α-SMA阳性细胞的总数，取平均值（以均数±标准差表示）。
　　8.进行组织培养时，一般培养2天后，组织块就会附着在容器壁上，培养至4-7天时，就会发现在离组织不远的地方有不规则的细胞。在生长空间充足的情况下，细胞呈现放射性生长;在较窄的空间里主要呈现横向生长。当组织被固定后，培养1周后细胞可以覆盖瓶底的70％。
　　9.波形蛋白抗体染色后细胞质呈绿色荧光阳性反应。角蛋白抗体染色后细胞质呈阴性着色。细胞核均被DAPI蓝染。从而证明培养的细胞为成纤维细胞。
　　10.采用不同浓度的雷帕霉素处理后，caspase-3，-9的mRNA表达量(F＞116.572，P＜0.001)和蛋白的相对表达量(F＞28.564，P＜0.001)随着雷帕霉素浓度的增加而增加，表现出浓度依赖性。但是caspase-8的mRNA表达量(F=0.671，P=0.618)和蛋白相对表达量(F=0.300，P=0.875)与对照组相比却未表现出显著的差别。
　　11.经过广谱caspase阻断剂处理后，由雷帕霉素引起的caspase-3，-9mRNA和蛋白水平增高的现象得到有效的阻断，而且广谱caspase阻断剂对于细胞基础caspase-3，-9 mRNA(t＞5.209，P＜0.001)和蛋白的表达(t＞5.357，P＜0.001)也有显著抑制作用。同时广谱caspase阻断剂亦能抑制caspase-8mRNA和蛋白的表达。
　　结论:
　　雷帕霉素具有抑制兔青光眼滤过术后滤过道中成纤维细胞过分增生，减少瘢痕形成的作用，延长了功能性滤过泡存活的时间。雷帕霉素可以通过增加caspase-3和-9的表达诱导RTFs细胞凋亡的发生.

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 雷帕霉素的生物学特性

1．2 雷帕霉素在眼科疾病中的应用

1．3 雷帕霉素毒性作用的相关研究

1．4 雷帕霉素眼用制剂及在眼内的安全性研究

1．5 结语

参考文献

第二章 前言

第三章 材料与方法

3．1 主要试剂

3．2 主要仪器及设备

3．3 主要试剂配置

3．4 全蛋白提取

3．5 实验动物及分组

3．6 雷帕霉素的配制

3．7 术后临床观察

3．8 取材与切片

3．9 阅片与数据分析

3．10 RTFs的培养、鉴定以及检测

3．11 统计学处理方法

第四章 结果

4．1 雷帕霉素对术后眼压影响的比较

4．2 雷帕霉素眼毒副作用的评价

4．3 滤过泡功能的评价

4．4 病理组织学评价

4．5 RTFs的体外培养以及鉴定

4．6 MTT分析法

4．7 流式细胞术检测不同浓度雷帕霉素对细胞凋亡的影响

4．8 不同浓度的雷帕霉素对caspase-3，-8，-9表达的影响

4．9 流式细胞术检测广谱caspase阻断剂对雷帕霉素引起细胞凋亡的影响

4．10 广谱caspase阻断剂对caspase-3，-8，-9表达的影响

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

中英文对照缩略词表

攻读学位期间研究成果

致谢

声明

统计学审稿证明