慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表达及其临床意义分析

摘要

本研究拟通过茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者及健康对照者唾液中miRNA-146a表达水平，分析其表达水平与牙周炎症程度的关系;通过对慢性牙周炎患者实施牙周基础治疗，对比治疗前后唾液中miRNA-146a的水平，并探讨其与牙周临床指标及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的关系，为牙周病基础治疗效果评估和病情发展预测等方面奠定基础。
　　本论文分为以下两个部分内容：
　　第一部分慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达水平的检测
　　1.目的：
　　本研究拟通过茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者及健康对照者唾液中miRNA-146a表达水平的差异，分析其表达水平与牙周主要临床指标及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的关系，为慢性牙周炎的临床诊断和治疗提供参考。
　　2.方法：
　　(1)研究对象:根据1999年美国牙周病分类研讨会提出的慢性牙周炎的诊断标准，慢性牙周炎患者（牙周炎组）选取自2012年1月至2014年5月于西南医院口腔科就诊的64例病患，其中男性38例，女性26例，平均年龄44岁。同时健康对照组选择本院体检的30例健康志愿者，包括男性17例，女性13例，平均年龄42岁。
　　(2)牙周检查及分组:详细记录所有研究对象牙周临床指标:菌斑指数(plaque index，PLI)、牙龈指数(gingival index，GI)、牙周探诊深度(probing depth，PD)和附着丧失(attachment loss，AL)。根据探诊深度、牙龈指数、附着丧失、X线片显示牙槽骨吸收程度来衡量牙周炎的程度，分组如下:
　　①健康对照组:牙龈指数=0，无附着丧失及牙槽骨的吸收，牙周探诊深度≤3mm，共30例。
　　②轻度牙周炎组:牙龈指数＞1，附着丧失1～2 mm，牙槽骨吸收长度＜1/3根长，牙周探诊深度≤4mm，牙松动不明显，共18例。
　　③中度牙周炎组:牙龈指数＞1，附着丧失3～4mm，牙槽骨吸收长度为1/3根长～1/2根长，牙周探诊深度≤6mm，多根牙有轻度根分叉病变，牙轻度松动，共24例。
　　④重度牙周炎:牙龈指数＞1，附着丧失≥5mm，牙槽骨吸收长度＞1/2根长，牙周探诊深度＞6mm，根分叉病变明显，牙多有松动，共22例。
　　(3)唾液采集:清晨采用棉签法采集受试者的唾液标本，在唾液采集前2小时受试者需空腹，不能喝水、喝酒、喝饮料、进食、抽烟、剧烈运动及情绪剧烈波动等。采样时受试者坐位、头稍前倾体位，棉签蘸柠檬酸刺激口腔唾液分泌，1.5分钟后吐出唾液，用10ml无RNA酶离心管收集唾液标本，立即于4℃，3000rpm，15分钟离心取上层液体，将收集好的唾液上清冻存于-80℃备用。
　　(4)唾液上清miRNA-146a表达检测:吸取1ml唾液上清提取和纯化唾液上清中的总RNA，提取步骤参照mirVana PARIS Kit试剂盒说明书进行。以miRNA-16作为内参，采用茎环引物进行反转录。用TaKaRa公司PrimeScript RTreagent Kit反转录试剂盒对提取的总RNA中的miRNA-146a反转录成cDNA。于-80℃冻存反转录产物待用。在ABI StepOne Plus实时定量PCR(Real-timePCR，RT-qPCR)仪上按照SYBR Premix Ex TaqTM PCR反应试剂盒进行RT-qPCR检测。反应总体积为20μl，每个标本做3个复孔。计算各标本平均循环阈值(cycle threshold，Ct)，将miRNA-146a的Ct值减去miRNA-16 Ct值作为△Ct值。采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析，计算标准化后的2-△Ct值表示miRNA-146a的相对表达含量。
　　3.结果：
　　(1)慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a的表达（2.72±0.81）显著高于健康对照组（0.82±0.36），差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　(2)轻度慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a表达水平为1.92±0.44，中度牙周炎组为2.71±0.58，重度牙周炎组为3.40±0.62，miRNA-146a在轻度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎之间表达呈显著增高(P＜0.01)。
　　(3)慢性牙周炎组唾液上清中miRNA-146a的表达水平与菌斑指数、牙龈指数、牙周探诊深度和附着丧失呈显著正相关，相关系数分别为r=0.752，P＜0.001;r=0.657，P＜0.001;r=0.586,P＜0.001;r=0.647,P＜0.001。
　　(4)慢性牙周炎患者唾液上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8的平均值分别为9.46±6.72pg/ml、48.20±14.97 pg/ml、6.26±4.05 pg/ml、145.97±43.68 pg/ml,均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。而IL-10水平（平均值为6.74±4.31 pg/ml）则显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.结论：
　　(1)慢性牙周炎组及健康对照组的唾液上清中均可检测到miRNA-146a表达，前者表达水平显著高于后者。
　　(2)慢性牙周炎组中，随着牙周破坏程度增加，患者唾液上清中miRNA-146a表达呈增高趋势。
　　(3)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表达与PLI、GI、PD和AL呈正相关性，提示其与牙周炎破坏程度密切相关。
　　(4)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表达与唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8呈正相关性，与IL-10呈负相关性。
　　第二部分牙周基础治疗对慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达水平的影响
　　1.目的：
　　采用茎环逆转录实时定量PCR检测慢性牙周炎患者在牙周基础治疗前后唾液上清中miRNA-146a表达情况，分析miRNA-146a表达在牙周基础治疗前后的变化趋势及其与牙周炎症程度之间的关系，探讨唾液上清中miRNA-146a是否可以为监测基础治疗疗效的客观指标。
　　2.方法:
　　以上述64例慢性牙周炎患者为研究对象进行牙周基础治疗，治疗前对纳入分析的慢性牙周炎患者进行口腔卫生宣教及口腔卫生指导，包括牙刷使用频率及方法、牙线使用等，然后行全口超声龈上洁治术、龈下刮治及根面平整术，治疗全过程在2周内完成。治疗后不给予抗生素辅助治疗。嘱患者治疗结束后第6周末进行牙周临床指标、唾液上清miRNA-146a及细胞因子TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平复查。采用SPSS17.0统计学软件对实验结果数据进行统计分析。计量资料采用(x)±s表示，牙周基础治疗前后唾液中miRNA-146a的表达水平比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。基础治疗前后miRNA-146a变化值(△miRNA-146a)与牙周主要临床指标变化值及细胞因子变化值的关系采用Pearson相关系数分析。
　　3.结果：
　　(1)最终按要求完成牙周基础治疗后进行复诊的患者共48例。慢性牙周基础治疗后第6周观察牙的PLI、GI、PD和AL均较治疗前显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　(2)48例治疗组患者基础治疗前（基线）唾液上清中miRNA-146a表达为2.85±0.92，治疗后第6周唾液上清中miRNA-146a表达为1.49±0.52，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　(3)直线相关分析结果显示，基础治疗前后△miRNA-146a与治疗前后菌斑指数变化值(△PLI)、牙龈指数变化值(△GI)、牙周探诊深度变化值(△PD)和附着丧失变化值（△AL）呈显著正相关，相关系数分别为r=0.412，P＜0.01;r=0.506，P＜0.001;r=0.470,P＜0.001;r=0.584，P＜0.001。
　　(4)慢性牙周基础治疗后第6周唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-8表达水平显著降低，与治疗前（基线）相比，差异有统计学意义。
　　(5)基础治疗前后△miRNA-146a与治疗前后唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8变化值(△TNF-a、△IL-1β、△IL-6、△IL-8)呈显著正相关，相关系数分别为r=0.547,P＜0.001;r=0.416,P＜0.001;r=0.352,P＜0.01; r=0.327，P＜0.01，与IL=10变化值(△IL-10)则呈负相关，相关系数为r=-0.403，P＜0.01。
　　4.结论：
　　(1)牙周基础治疗能显著降低慢性牙周炎患者PLI、GI、PD和AL临床指标，提示基础治疗可以有效改善牙周组织的炎症状况。
　　(2)慢性牙周炎患者经基础治疗后唾液上清中miRNA-146a表达降低。
　　(3)牙周基础治疗前后唾液上清miRNA-146a变化值与治疗前后PLI、GI、PD和AL的变化值呈正相关性。
　　(4)牙周基础治疗前后唾液上清△miRNA-146a与治疗前后唾液中△TNF-a、△IL-1β、△IL-6、△IL-8呈正相关性，与△IL-10呈负相关性。

目录

摘要

前言

第一章 慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达的检测

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二章 牙周基础治疗对慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相关因子表达的影响

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

英文缩略词

成果

致谢

声明