骨髓间充质干细胞功能机制实验研究——从结构功能追踪到调节小胶质细胞参与免疫/抗炎过程

摘要

本课题深入研究BMSCs对CNS损伤疗效机制，以BMSCs分泌的TSG-6为研究重点，探讨其是否对小胶质细胞的激活有调节作用，以及其发挥作用的可能机制。为BMSCs治疗CNS损伤提供实验依据和新思路。
　　本文从以下几部分进行论述：
　　第一章 用于神经细胞成像的锰离子最适条件探索
　　目的：
　　拟利用锰增强磁共振成像(MEMRI)技术，从移植细胞与宿主神经细胞突触形成及功能活动的显像角度，探讨BMSCs移植治疗CNS损伤的疗效机制。首先确定锰离子是否可以在对皮层神经元无毒条件下显著提高皮层神经元的磁共振信号强度。
　　方法：
　　原代Wistar大鼠皮层神经元培养。当细胞生长到第7天时，神经元用不同浓度的氯化锰处理:分别为对照组、0.01、0.05、0.10、和0.20mMol/L组;然后消化细胞进行MRI检查，通过ICP-MS分析细胞内的锰离子含量。不同实验组在以锰处理24小时后，再以细胞计数法(cell counting kit，CCK-8)检测细胞存活率，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验测定细胞毒性，2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐(2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DC FH-DA)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，原位末端标记(TdT-mediated dUTPNick-End Labeling，TUNEL)染色法测定细胞凋亡。
　　结果：
　　与对照组相比，0.01 mMol/L浓度锰处理的神经元在MEMRI上没有显著信号增强。当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L时，神经元信号强度显著提高，分别为:对照组133.00±18.52;0.01 mMol/L锰处理组194.00±30.32;0.05 mMol/L锰处理组313.67±54.37;0.1 mMol/L锰处理组466.67±51.94;以及0.2 mMol/L锰处理组658.33±110.56。但与此同时，当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L时，其对细胞活性影响也非常明显。与对照组相比，0.05 mMol/L、0.10 mMol/L和0.20 mMol/L锰处理组的细胞活力分别为68.30±7.97％、54.98±9.08％和41.52±4.36％。各组培养上清中的LDH水平分别是对照组的2.04倍、2.80倍和4.99倍。细胞内ROS的形成显著增加，0.05mMol/L、0.10mMol/L和0.20 mMol/L锰处理组神经细胞内ROS水平分别是对照组的1.83倍，2.38倍和3.24倍。TUNEL细胞凋亡实验提示:0.01mMol/L锰处理组与对照组相比无统计学差异，对照组为8.15±1.43％，0.01mMol/L锰处理组为9.24±0.73％;0.05、0.10和0.20mMol/L锰处理组则随着锰离子浓度增高，神经元凋亡率也逐渐增高。细胞凋亡率在0.05 mMol/L锰处理组为18.15±0.81％，0.10mMol/L锰处理组为23.63±0.86％，和0.20 mMol/L锰处理组为35.26±3.54％。
　　结论：
　　当锰离子处理浓度大于等于0.05mMol/L，可以显著提高神经元MRI的信号强度，但这种浓度对细胞毒性作用也非常显著。
　　以上实验结果结合MEMRI目前难以达到细胞分子水平显像的现状，本课题暂没有再深入进行BMSCs与宿主形成突触、完成功能整合方面的MEMRI追踪研究，但的确“BMSCs与宿主组织产生结构整合”的前期工作结果乐观，对“BMSCs与宿主神经元在产生结构整合基础上的功能整合追踪”研究仍是可探寻领域，期待未来在合适情况下、以更有利于细胞成像而又无毒无创的显影剂来代替已有的Mn2+，并期待能在更高分辨率MRI条件下再进行深入研究。后续研究中，我们仍以BMSCs功能疗效机制为关注点，从BMSCs参与调控小胶质细胞功能、进而发挥受损CNS功能修复的疗效机制角度进行了探讨。
　　第二章 BMSCs抑制脂多糖引起的小胶质细胞激活的机制研究。
　　目的：
　　研究BMSCs以及TSG-6对LPS激活的小胶质细胞内促炎介质的表达以及炎症反应信号传导通路的影响。
　　方法：
　　为了研究BMSCs对小胶质细胞引起神经炎症的作用机制，我们在体外利用LPS诱导BV2小胶质细胞激活的模型。利用6孔transwell培养板来评估BMSCs或TSG-6对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激BV2细胞的作用。首先，5×105个BV2细胞培养于下腔室。实验组用LPS100ng/mL的刺激6h，对照组不加刺激。在上室加入BMSCs（细胞数亦为5×105个）或者不同浓度的TSG-6。具体分组如下:(1)单纯LPS刺激组;(2)单纯BMSCs处理组（LPS-BMSCs组）;(3)转染TSG-6siRNA的BMSCs处理组（LPS-TSG-6 siRNA BMSCs组）;(4)转染control siRNA的BMSCs处理组（LPS-control siRNA BMSCs组）;(5)rmTSG-61ng/ml刺激组;(6) rmTSG-610ng/ml刺激组;(7) rmTSG-6100ng/ml刺激组。
　　以上各条件处理6小时后，对BV2小胶质细胞中的TNFα，IL1β，IL6和iNOS基因表达水平以实时定量PCR进行检测。为进一步阐明TSG-6对小胶质细胞中发挥抗炎作用的分子机制，我们分别采用了免疫荧光染色、凝胶迁移率实验以及荧光素酶报告基因实验，评估了NF-κB信号通路活性;同时以western blot评估了TSG-6对MAPK信号通路的作用。又由于LPS可通过作用于Toll样受体4(TLR4)使小胶质细胞激活，而CD44是TLR2和TLR4所介导炎症反应的负调节分子，因此，为进一步了解CD44的作用及其在调节LPS刺激的小胶质细胞功能时与TSG-6之间的关系，我们用CD44-siRNA沉默BV2细胞中CD44的表达（CD44-siRNA BV2组），并重复了上述部分实验，以明确CD44在TSG-6对小胶质细胞功能调节过程中所发挥的作用及机制。结果
　　结果：
　　干细胞显著抑制小胶质细胞活化后促炎因子mRNA的表达。LPS和LPS-BMSCs两组之间炎症因子表达差异分别为:TNFα，11.13±1.53/2.77±0.99，(P＜0.05); IL1β，5.70±0.56/2.28±0.17(P＜0.05);IL6,11.67±1.15/3.23±0.42(P＜0.05);和iNOS,4.73±0.23/2.47±0.40(P＜0.05)。此外，不同浓度的rmTSG-6，1ng/ML(P＜0.05)，10ng/ML(P＜0.05)，100ng/ML(P＜0.05)也可以减少小胶质细胞中这些促炎介质的表达。但是，当BMSCs中TSG-6的表达被沉默时，BMSCs对小胶质细胞的影响则减弱，LPS-BMSCs与LPS-TSG-6 siRNA BMSCs两组TNFα(P＜0.05)，IL1β(P＜0.05)，IL6(P＜0.05)和iNOS(P＜0.05)相对表达分别为:2.97±0.99/6.01±0.32(P＜0.05);2.28±0.17/4.02±0.26(P＜0.05),3.23±0.42/7.68±1.14(P＜0.05)，2.47±0.40/3.55±0.37(P＜0.05)。研究炎症相关信号通路时，我们发现TSG-6可显著抑制LPS刺激后BV2细胞中NF-κB转录活性(P＜0.05)以及MAPK通路中ERK，P38，JNK的磷酸化水平。为探讨BMSCs或rmTSG-6是否通过CD44发挥作用，首先利用siRNA沉默BV2细胞中CD44表达;当CD44表达受抑制后，BMSCs或rmTSG-6对BV2小胶质细胞内炎症因子TNF-α（BV2细胞/转染CD44siRNA BV2细胞，BMSCs处理组为:3.43±0.50/8.27±0.35，P＜0.05; rmTSG-6处理组为:5.48±0.87/12.33±0.87，P＜0.05）和IL-1β（BV2细胞/转染CD44siRNA BV2细胞，BMSCs处理组为:2.63±0.32/3.93±0.35，P＜0.05; rmTSG-6处理组为:2.82±0.66/6.33±0.25，P＜0.05）表达的抑制作用减弱。当BV2细胞中CD44表达受抑制后，BMSCs或rmTSG-6对BV2小胶质细胞内NF-κB转录活性的抑制作用明显降低(P＜0.05)。同样地，Western blotting对MAPK信号通路的检测结果表明，与对照BV2细胞中相比，BMSCs或rmTSG-6对转染CD44-siRNA的BV2细胞的ERK、P38和JNK蛋白磷酸化抑制作用显著降低。
　　结论：
　　本研究结果表明，干细胞可以通过释放TSG-6来调节小胶质细胞的功能。BMSCs和TSG-6通过小胶质细胞上的CD44受体而抑制炎症基因的表达和炎症相关信号通路NF-κB、MAPK的激活。BMSCs对小胶质细胞免疫调节作用的新机制，提示可考虑将干细胞及TSG-6作为脑外伤或神经炎性疾病治疗的新途径。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 用于神经元成像的锰离子最适条件探索

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

五、第一章附图和说明

第二章 BMSCs对LPS激活的小胶质细胞的影响及机制研究

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

参考文献

五、第二章附图和说明

全文总结

英文缩略词对照表

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