组蛋白去乙酰化酶1、6在胶质瘤发生、发展中的作用及其机制研究

摘要

恶性神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，复发率高，死亡率高，预后较差。HDACs是一个非常庞大的家族，在真核细胞生物内，HDACs被分成4大类，共包括18种同工酶。其中，组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases-1，HDAC1)可能是这些同工酶中最重要的之一，与恶性肿瘤的发生、发展有着密切的联系。
　　本研究中，我们首先检测了正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中HDAC1、HDAC6的表达水平，结果表明HDAC1、HDAC6在胶质瘤组织中较正常脑组织中表达增高，可望将HDAC1、HDAC6作为抗胶质瘤治疗的潜在靶点;接下来，我们分别研究了基因敲除或过表达HDAC1后恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力的变化以及使用HDAC6抑制剂(ACY-1215)抑制HDAC6后恶性胶质瘤细胞增殖能力的变化;最后，我们探讨了PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路在HDAC1调控恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭过程中的作用机制，以及TGF-β/SMAD信号通路在HDAC6调控恶性胶质瘤细胞的增殖过程中的作用机制。
　　第一部分 组蛋白去乙酰化酶1在恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭中的作用及其机制
　　第一章 HDAC1在正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况
　　目的:探讨HDAC1在正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况。
　　方法:收集南方医科大学珠江医院、暨南大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院71例手术切除的脑胶质瘤病理组织及12例癫痫颞叶切除及脑外伤内减压时切除的相对正常脑组织。采用免疫组化及RT-qPCR检测组织标本中HDAC1的蛋白及mRNA表达水平。采用t检验、单因素方差分析及卡方检验进行统计分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果:胶质瘤组织中HDAC1的蛋白表达水平高于正常脑组织(P=0.03);胶质瘤组织中HDAC1的mRNA表达水平高于正常脑组织(P=0.000)，不同病理级别之间HDAC1的mRNA表达水平无差异(P=0.837)，表明HDAC1 mRNA表达与脑胶质瘤的病理级别无相关性。
　　结论:HDAC1的蛋白及mRNA表达水平在胶质瘤组织中较正常脑组织中增高，提示HDAC1可能在胶质瘤的发生发展中发挥重要作用。
　　第二章 HDAC1影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程
　　目的:探讨基因敲除及过表达HDAC1能否对U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力产生影响。
　　方法:以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象，分别采用小分子RNA(siRNA)干扰技术敲除HDAC1及质粒转染过表达HDAC1;利用Western Blot检测U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达情况;MTS增殖实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力，Transwell侵袭实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。采用t检验、单因素方差分析进行统计分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果:siRNA干扰技术敲除HDAC1后，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达水平明显下降，提示转染成功，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力下降(P＜0.05);质粒转染过表达HDAC1后，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达增加，提示转染成功，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭能力增强(P＜0.05)。
　　结论:HDAC1可对恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力产生影响，进一步证实了HDAC1在胶质瘤的发生、发展中发挥着重要作用，有望将其作为抗胶质瘤治疗的潜在靶点。
　　第三章 HDAC1通过调控PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程。
　　目的:探索PI3K/AKT及MEK/ERK信号传导通路在HDAC1调控胶质瘤细胞增殖、侵袭过程中的作用及机制。
　　方法:以胶质瘤细胞系U87MG为研究对象，分别采用siRNA干扰技术敲除HDAC1及质粒转染过表达HDAC1，同时予以PI3K及MEK特异性抑制剂抑制相关信号通路。实验分组如下:siRNA干扰基因敲除HDAC1实验分为3组:正常组、干扰对照组、siRNA干扰HDAC1基因敲除组;质粒转染过表达HDAC1实验分为6组:正常组、过表达对照组、HDAC1过表达组、HDAC1过表达+PI3K抑制组、HDAC1过表达+MEK抑制组、HDAC1过表达+PI3K抑制+MEK抑制组。利用Western Blot检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白的表达情况;MTS增殖实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力，Transwell侵袭实验检测各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。采用t检验、单因素方差分析进行统计分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果:siRNA干扰技术敲除HDAC1后，干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞HDAC1蛋白的表达水平明显下降，提示转染成功，干扰组U87MG恶性胶质瘤细胞中AKT、ERK总蛋白水平无变化，p-AKT、p-ERK蛋白水平下降，U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力下降;质粒转染过表达HDAC1后，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达增加，提示转染成功，各实验组U87MG恶性胶质瘤细胞中AKT、ERK总蛋白水平无变化，HDAC1过表达组p-AKT、p-ERK蛋白水平升高，U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较正常组增强，HDAC1过表达+PI3K抑制组p-AKT蛋白水平下降、p-ERK蛋白水平无变化，U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组下降，HDAC1过表达+MEK抑制组p-ERK蛋白水平下降，p-AKT蛋白水平无变化，U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组下降，HDAC1过表达+PI3K抑制+MEK抑制组p-AKT、p-ERK蛋白水平下降，U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力较HDAC1过表达组明显下降(P＜0.05)。
　　结论:HDAC1可能通过异常激活PI3K/AKT和MEK/ERK信号传导通路来调控恶性胶质瘤细胞的增殖及侵袭过程，本研究有望为恶性胶质瘤的治疗找寻到新的靶点及突破口。
　　第二部分 组蛋白去乙酰化酶6在恶性胶质瘤细胞增殖中的作用及其机制
　　第一章 HDAC6在正常脑组织及恶性胶质瘤组织中的mRNA表达情况
　　目的:探讨HDAC6在正常脑组织及恶性胶质瘤组织中mRNA表达差异。
　　方法:收集南方医科大学珠江医院、暨南大学附属第一医院、中山大学附属肿瘤医院12例手术切除的脑胶质瘤病理组织及12例癫痫颞叶切除及脑外伤内减压时切除的相对正常脑组织，采用qPCR检测组织标本中HDAC1的mRNA表达水平。采用t检验进行统计分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果:胶质瘤组织中HDAC6的mRNA表达水平高于正常脑组织(P＜0.05)，表明HDAC6 mRNA水平在脑胶质瘤组织中存在高表达。
　　结论:HDAC6在胶质瘤组织中较正常脑组织中表达增高，提示HDAC6同样可能在胶质瘤的发生、发展中发挥着重要作用。
　　第二章 HDAC6通过调控TGF-β/SMAD信号通路对恶性胶质瘤细胞的增殖过程产生影响
　　目的:探索TGF-β/SMAD信号传导通路在HDAC6调控胶质瘤细胞增殖过程中的作用及机制。
　　方法:以恶性胶质瘤细胞系A-172、U87MG为研究对象，分别利用HDAC6抑制剂(ACY-1215)抑制HDAC6及SMAD2磷酸化的诱导剂（重组人TGFβ1）加入各实验组中，实验分组如下:阴性对照组（无任何干预）、ACY-1215组（A-172、U87MG胶质瘤细胞中分别加入HDAC6抑制剂ACY-1215）、重组人TGFβ1组（A-172、U87MG胶质瘤细胞中分别加入重组人TGFβ1）;利用Western Blot检测各实验组A-172、U87MG恶性胶质瘤细胞中HDAC6、SMAD2、p-SMAD2、p21蛋白的表达情况;MTT增殖实验检测各实验组A-172、U87MG恶性胶质瘤细胞的增殖能力，探讨HDAC6能否通过激活TGF-β/SMAD相关的信号通路来调控胶质瘤细胞的增殖能力。利用软件SPSS16.0对实验数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析;P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果:实验组加入HDAC6抑制剂ACY-1215后，Western blot实验结果表明实验组A-172、U87MG胶质瘤细胞中HDAC6蛋白的表达水平明显下降，抑制剂ACY-1215能显著提高SMAD2的磷酸化，以及提高后续的一种众所周知的细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂p21的表达量，重组人TGFβ1显著诱导SMAD2的磷酸化并能显著提高p21的含量，但并不影响HDAC6蛋白水平;同时，MTT增殖实验结果表明抑制HDAC6后能显著降低的胶质瘤细胞的增殖能力(P＜0.05)，重组人TGFβ1的干预作用可抑制恶性胶质瘤细胞的增殖能力(P＜0.05)。
　　结论:恶性胶质瘤细胞的增殖能力可被HDAC6抑制剂(ACY-1215)显著抑制，HDAC6可通过抑制TGFβ/SMAD信号传导通路来促进恶性胶质瘤细胞的增殖，该研究有望为恶性胶质瘤的治疗找寻到新的治疗靶点。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 组蛋白去乙酰化酶1在恶性胶质瘤细胞增殖、侵袭中的作用及其机制

第一章 HDAC1在正常脑组织及不同病理级别胶质瘤组织中的蛋白及mRNA表达情况

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二章 HDAC1影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三章 HDAC1通过调控PI3K／AKT及MEK／ERK信号通路影响恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭过程

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 组蛋白去乙酰化酶6在胶质瘤细胞增殖中的作用及其机制

第一章 HDAC6在正常脑组织及恶性胶质瘤组织中的mRNA表达情况

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二章 HDAC6通过调控TGF-β／SMAD信号通路对恶性胶质瘤细胞的增殖过程产生影响

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

全文总结

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