腹泻患者和生态环境香港海鸥菌的检测及多位点序列分型研究

摘要

研究目的：
　　1.收集广州市医院门诊腹泻病例的粪便标本进行香港海鸥菌检测并收集相关信息，计算发病率以了解广州地区香港海鸥菌所致腹泻的发病状况，并探索危险因素;
　　2.采集广州市的淡水鱼、食用蛙、食用螺（中华圆田螺、福寿螺）进行香港海鸥菌检测，收集阳性菌株，以了解目前广州市淡水产品中香港海鸥菌的感染情况及各宿主之间联系;
　　3.检测广州市环境水体中香港海鸥菌以探索其携带状况;
　　4.为深入阐明LH的耐药性及分子遗传特征，进行以下研究:分析LH分离株抗生素耐药表型;运用多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技术对不同宿主来源的LH分离株进行分型分析，评价菌株间的遗传亲缘关系。
　　研究方法：
　　1.广州市某综合医院门诊腹泻病人粪便标本、广州市农贸市场淡水产品（淡水鱼、食用蛙、福寿螺）及水库水样中香港海鸥菌检出情况的调查研究
　　1.1 标本收集和资料获取:
　　2013年5月至2014年11月收集医院感染疾病科门诊，消化科门诊和急诊科胃肠炎腹泻患者的粪便标本;病人的一般情况、临床表现及流行病学资料通过自制的《感染性腹泻调查表》获得;
　　2013年12月至2014年5月选择广州市4家农贸市场，采集淡水产品，包括草鱼、虎纹蛙、中华圆田螺，所采样品单独采集后室温状态即时送实验室检测。
　　在广州市内各区（白云区、天河区、黄浦区、花都区、番禺区、萝岗区）分别选择一个水库（和龙水库、新塘水库、黄埔水库、金钟水库、浑坑水库、新陂水库）共6个水库进行采样，所取水样按无菌原则采集后立即送检。
　　1.2 实验室检测:
　　1.2.1 香港海鸥菌培养及生化鉴定
　　收集到的腹泻病人标本所采集粪便标本立即放入Cary-blair氏运送培养基，48h内送到实验室进行细菌培养鉴定，粪便标本直接划线改良头孢哌酮酮MacConkey琼脂(CMA)平皿，头孢哌酮浓度为16mg/L，CMA培养皿置37℃恒温培养箱培养48小时，试验均以HKU1菌株（香港大学微生物学系袁国勇教授惠赠）作为阳性对照菌株。可疑细菌进行革兰染色、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和三糖铁等关键生化试验筛选，以上均符合者再采用API鉴定。
　　淡水产品标本在本实验室经相应处理后得到的肠道棉拭子接种LH选择性培养基，及改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿，后检测步骤同上。
　　水库水样采集需在24h内送回实验室进行检测，采用滤膜法进行加压过滤，然后将滤膜置于改良头孢哌酮MacConkey琼脂(CMA)平皿进行培养，后检测步骤同上。
　　1.2.2 香港海鸥菌基因鉴定
　　1.2.2.1 特异性片段聚合酶链反应(PCR)
　　扩增目的片段是香港海鸥菌16S rRNA基因特异性序列，上游序列为:5'-ATCCCTAAGGCTAATACCCT-3'，下游序列为:5'-TCTCTTCGAGGTTCGGTA-3'，扩增片段大小为550bp。反应体系:总体积:50μL，其中10xPCR缓冲液5μL，25mmol/L MgCl24μL，2.5 mmol/L dNTPs4μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.25μL，0.6mmol/L引物各1μL，模版DNA5μL，双蒸水29.75μL。反应条件为94.0℃5min，94.0℃30S，53.0℃40S，72.0℃40S，35个循环，72.0℃5min。用DL2000作为PCR扩增产物的Marker，以LH人源株(HKUI，香港大学医学院微生物学系袁国勇教授惠赠)为阳性对照，以大肠杆菌ATCC25922为阴性对照。
　　1.2.2.2 16S rRNA PCR扩增与测序
　　方法同上，引物设计参照文献[1]，扩增16S rRNA基因序列，序列为:LPW264:5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3',LPW265:5'-GNTACCTTGTTACGACTT-3'，长度为1495bp。PCR扩增产物送华大基因公司进行序列测定。
　　2.纸片扩散法确定LH人源分离株的抗生素敏感性
　　采用WHO推荐的K-B纸片扩散法测，判定标准按美国CLSI/NCCLSM100-519抗微生物药物敏感性试验执行标准(2009版)肠杆菌科抑制圈直径的解释标准执行。敏感(susceptible，s)率、中介(intermediate，I)率、耐药(resistant，R)率分别用S％、I％、R％表示。并用大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作质控。
　　研究结果：
　　1.广州市人群现场LH研究
　　于2013年5月-2014年11月采集广州市某综合医院门诊腹泻患者545例（编号:1004-1548）粪便进行香港海鸥菌的检测，目前未发现香港海鸥菌感染阳性病例。
　　2.广州市部分淡水产品LH检测结果
　　324份淡水产品中共检出香港海鸥菌53株，阳性率为16.36％(53/324)，其中草鱼256份，香港海鸥菌在草鱼的阳性率为17.97％(46/256)，15只虎纹蛙中检出7只阳性，阳性率为46.67％。中华圆田螺53份，未检出LH。
　　3.广州市各区水库水样LH检测结果
　　于白云区和龙水库的水样培养分离出香港海鸥菌，经过生化鉴定及16SrRNA基因序列测定，并与GenBank中登录的香港海鸥菌(菌株号HKUI)进行序列比对，其同源性均为99％，这是目前广东省广州市水库中首次发现香港海鸥菌。
　　水库分离株菌落形态:CMA培养基37℃培养48h后，菌落呈灰白色、半透明、圆形、略凸起、直径在1.0-1.5mm之间、光滑、不粘连，略显湿润，革兰氏染色镜检为革兰氏阴性，形状呈螺旋杆状或展翅海鸥形状。
　　水库分离株的生化检测结果:均为革兰氏阴性菌，氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、精氨酸双水解酶、硝酸盐还原酶、甘露醇、葡糖酸盐、癸酸盐等阳性，三糖铁、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、硫化氢、吲哚、3-羟基丁酮、明胶酶、β-半乳糖苷酶、纤维糖、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖、葡萄糖等阴性。
　　4.广州市分离株药敏结果
　　54株LH分离株对10个种类常用抗生素中的19种药物均表现不同程度的耐药性。耐药率从高到低依次如下:头孢哌酮(53/54，98.15％)，头孢唑啉(52/54，96.30％)，头孢噻吩(51/54，94.44％)，氨苄西林(44/54，81.48％)，利福平(38/54，70.37％)，红霉素(15/54，27.78％)，哌拉西林(11/54，20.37％)，四环素(10/54，18.52％)，头孢他啶(8/54，14.81％)，环丙沙星(7/54，12.96％)，头孢吡肟(6/54，11.11％)，氨曲南(5/54，9.26％)，链霉素(4/54，7.41％)，头孢呋辛(4/54，7.41％)，复方新诺明(3/54，5.56％)，氯霉素(2/54，3.70％)，亚胺培南(1/54，1.85％)，阿米卡星(1/54，1.85％)，庆大霉素(0/54，0％)。各种分离株均发现对头孢菌素类抗生素表现耐药，大多数对第一、三代头孢菌素表现耐药，而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药性。大多数分离株对利福平表现耐药。
　　研究结论：
　　1.本次研究对广州市某综合医院545例门诊腹泻患者粪便进行香港海鸥菌的检测，目前未发现香港海鸥菌感染阳性病例。324份淡水产品中共检出香港海鸥菌53株，其中香港海鸥菌在草鱼的阳性率为17.97％，虎纹蛙中阳性率为46.67％。中华圆田螺中未检出。本研究在广州市水库水样中分离出香港海鸥菌，证明了在天然水环境中存在香港海鸥菌。因此，携带香港海鸥菌的水库水可能为香港海鸥菌的感染渠道。同时，水库是淡水鱼类等淡水产品的常见生活环境，因而作为香港海鸥菌传播途径的环境媒介，对香港海鸥菌的流行具有重要意义。
　　2.各种分离株均发现对头孢菌素类抗生素表现耐药，大多数对第一、三代头孢菌素表现耐药，而对第二、四代头孢菌素表现较低的耐药性。大多数分离株对利福平表现耐药。大多数分离株对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星等药物较敏感。
　　3.本研究所采用的MLST研究方案为选取rho、ancB、ftsH、trpE、ilvC、thiC、eno等7个管家基因，7个管家基因的多态位点总数目为298个。本次研究针对7个管家基因进行基因重组分析，提示rho、thiC等2个管家基因可能存在基因内基因重组现象;同时其余5个管家基因acnB、ftsH、trpE、ilvC、eno等未存在基因内基因重组现象。

目录

摘要

前言

第一章 广州市某医院腹泻患者及生态环境中香港海鸥菌的调查研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 香港海鸥菌耐药表型研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 香港海鸥菌MLST分型及相关分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

硕士期间论文发表情况

致谢

声明