倍半萜烯内酯类化合物衍生物对db/db小鼠胰岛细胞的保护作用

摘要

目的:
　　本研究以自发性2型糖尿病模型-db/db小鼠为实验研究对象，通过检测相关指标来了解自主合成的倍半萜烯内酯类化合物衍生物对小鼠血糖、血胰岛素、血脂、炎症因子及胰岛细胞中NF-κB、iNOS、Bcl-2、Bax等表达的影响，观察胰岛的形态改变，探讨这种新的衍生物对2型糖尿病小鼠胰岛β细胞的保护作用及其可能的机制。
　　方法:
　　SPF级15周龄db/m小鼠12只、db/db小鼠24只，雌雄各半，给所有小鼠予基础饲料适应性饲养1周后，db/mn小鼠设为正常对照组(n=12)，db/db小鼠随机分为2组:糖尿病模型组(n=12)、倍半萜烯内酯类化合物衍生物干预组(ACT001干预组，n=12)。ACT001干预组db/db小鼠每日固定时间给予ACT001混悬液25mg/kg灌胃1次，正常对照组及糖尿病模型组小鼠分别给予相应剂量的生理盐水灌胃，各组小鼠自由进食饮水，各组小鼠监测体重和血糖。小鼠禁食12小时后，从其尾静脉取血检测血糖。灌胃给药12周后实验结束，处死小鼠。将小鼠予戊巴比妥钠麻醉后，留其取血标本用于检测血清胰岛素、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterole，TC);留取小鼠胰腺组织标本用于检测组织NF-κB、iNOS、Bcl-2、Bax的表达。
　　1.血清学指标的测定
　　小鼠空腹血糖用罗氏ACCU-CHEK血糖仪测定;血清胰岛素用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒测定，小鼠血TG、TC等指标均用全自动生化分析仪测定。
　　2.血脂的测定和IL-1β、TNF-α含量的测定
　　小鼠血清IL-1β、TNF-α用ELISA试剂盒测定。
　　3.小鼠胰腺组织形态学检查
　　取小鼠胰腺尾部组织用4％多聚甲醛固定24小时后，经梯度酒精脱水，予石蜡包埋，将石蜡切片，切片厚度约为4μm，予HE染色观察胰岛的一般形态学变化，免疫组化染色检测小鼠胰岛细胞团NF-κB、iNOS、Bcl-2、Bax表达的变化。
　　4.免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠胰腺组织中NF-κB、iNOS蛋白表达的变化。
　　5.统计方法
　　本实验所有计量资料数据采用均数土标准差（X±S）表示，所有统计数据由统计软件SPSS19.0进行分析完成;各组间均数采用两样本t检验进行比较，多组间样本均数的比较采用单因素方差分析(One-Way analysis of variance，ANOVA);若方差不齐时，组间均数比较用Welch检验，两两比较用Dunnett's T3方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.各组小鼠一般情况的变化
　　正常对照组小鼠一般情况良好，精神状态佳，活动自如，毛发亮泽，饮食及大小便无异常，未见死亡;糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠一般情况较差，精神状态欠佳，行动缓慢，毛发杂乱无光，有脱发、皮疹，出现了多饮多尿多食等糖尿病相关症状;与糖尿病模型组比较，ACT001干预组小鼠上述情况均有所改善。
　　2.各组小鼠体重的变化
　　干预12周实验结束后，与正常对照组小鼠相比较，糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠体重明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);糖尿病模型组与ACT001干预组相比体重未见明显差异。
　　3.各组小鼠血清学指标的变化
　　干预12周实验结束后，与正常对照组小鼠相比较，糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠空腹血糖、胰岛素浓度、TG、TC均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病模型组小鼠比较，ACT001干预组小鼠上述指标有降低(P＜0.05)。
　　4.各组小鼠血清IL-1β、TNF-α表达水平的变化
　　干预12周实验结束后，与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠血清IL-1β、TNF-α表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病模型组小鼠比较，ACT001干预组小鼠血IL-1β、TNF-α表达水平均有降低(P＜0.05)。
　　5.各组小鼠胰腺组织形态学变化:
　　HE染色显示:正常对照组小鼠胰腺组织镜下胰岛数量多，呈团索状，为圆形或类圆形，胞浆丰富，形态完整，细胞核居中、胞界清晰;糖尿病模型组小鼠胰岛数量较少，分布零散，形态不规则，边缘不整齐，界限不清晰，细胞体积增大，细胞核呈偏心分布，可见空泡状变性;与糖尿病模型组小鼠相比较，ACT001干预组小鼠的胰岛形态改变有较明显的改善。
　　免疫组化染色显示:与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠胰岛细胞中NF-κB、iNOS及促凋亡因子Bax表达明显增强，抗凋亡因子Bcl-2表达减弱，差异有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病模型组小鼠比较，ACT001干预组小鼠胰岛细胞中NF-κB、iNOS、Bax表达有减弱，Bcl-2表达增强(P＜0.05)。
　　6.蛋白免疫印迹法检测各组小鼠NF-κB、iNOS蛋白表达的变化
　　与正常对照组小鼠比较，糖尿病模型组、ACT001干预组小鼠胰岛细胞中NF-κB、iNOS蛋白表达明显增强，差异有统计学意义(P＜0.05);与糖尿病模型组小鼠比较，ACT001干预组小鼠胰岛细胞中NF-κB、iNOS蛋白表达有明显减弱(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.db/db小鼠与db/m小鼠相比，体重、进食量、饮水量增加，空腹血糖、血脂升高，胰岛素浓度增加。
　　2.db/db小鼠与db/m小鼠相比，血清中IL-1β、TNF-α产生和释放增多。
　　3.db/db小鼠与db/m小鼠相比，胰岛细胞中NF-κB、iNOS、Bax表达增强，以及Bcl-2表达减弱，这可促使胰岛β细胞功能受损，凋亡增加。
　　4.倍半萜烯内酯类化合物衍生物可降低db/db小鼠空腹血糖、血脂、胰岛素浓度及减少血清中IL-1β、TNF-α的表达和释放。
　　5.倍半萜烯内酯类化合物衍生物可抑制db/db小鼠胰岛细胞中NF-κB的激活，下调iNOS的表达，改善胰岛β细胞功能受损，减少β细胞凋亡的发生。
　　6.倍半萜烯内酯类化合物衍生物可使db/db小鼠胰岛细胞中促凋亡因子Bax的表达减弱、抗凋亡因子Bcl-2的表达增强，改善胰岛β细胞中的凋亡现象。
　　7.本实验采用自主合成的倍半萜烯内酯类化合物衍生物作为NF-κB有效抑制剂，具有改善细胞凋亡、保护胰岛β细胞的作用。

目录

摘要

前言

第一章 材料与方法

1．材料

2．实验方法

3．统计学分析

第二章 结果

1．各组小鼠一般情况的变化

2．各组小鼠体重的变化

3．各组小鼠生理生化学指标的变化

4．各组小鼠血清IL-1β、TNF-α的变化

5．各组小鼠组织病理学变化

6．各组小鼠胰腺组织Western blot蛋白定量的变化

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

中英文缩略词对照表

学习期间发表论文情况

致谢

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