广东省2007-2013年肠炎沙门氏菌耐药特征及分子分型研究

摘要

研究背景:
　　沙门菌是革兰氏阴性杆菌，属肠杆菌科，在自然界有广泛宿主分布，存在于大多数动物及人的胃肠道中;也常常存在于水、蛋及蛋制品、肉类及其他食品中。根据O抗原（菌体抗原）及H抗原（鞭毛抗原）的抗原特性进行分类，沙门菌有2500多种血清型;其中鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌是人兽共患最常见的血清型。患者感染常出现腹泻、腹痛、呕吐等症状;沙门菌感染多为自限性疾病，患者可自愈，但败血症等并发症需要抗生素治疗。
　　沙门菌污染食品致腹泻暴发由以前的点源性集中暴发，越来越多地转变为跨地区跨州（省）的散在暴发形式出现，使污染源及传播途径的发现更需要分子分型手段的辅助及确认。分子水平上的分型方法一般包括三种:基于DNA序列多态性分析的分型方法、基于扩增特定基因产物的PCR分型方法、以及基于细菌DNA的限制性内切酶分析的分型方法。
　　脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世纪80年代中期发展起来的用于分离大分子量线性DNA分子的一种电泳技术，被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”。其原理是在琼脂糖凝胶上外加方向、时间与电流大小交替改变的脉冲电场，从而使得DNA分子得到有效地分离。通过比较DNA分子电泳图谱来确认菌株之间的关联。菌株间由于酶切位点突变、插入序列不同等原因会产生不同图谱，一般认为电泳条带差异越少则基因差异越小，菌株亲缘关系则越近;反之则菌株间无相关性，但对亲缘关系较远的菌株分型效果不佳。PFGE适于研究一个暴发事件中，菌株之间的来源关系。
　　多位点序列分型技术(multi-locus sequence typing，MLST)基于核酸序列测定技术，通过测定基因序列的变化反映菌株之间的进化关系，在推论菌株间遗传进化关系和种群相关性等方面有其他分型方法无可比拟的优势。其具有每种细菌的等位基因信息可通过互联网使其全球标准化，具有快速、实验结果可比性高和分辨水平高等优点。由于他们遗传稳定性，他们不能为短期的流行病学研究提供有力的帮助。故MLST适于研究在一个大群体内，一段时期内，菌株之间的亲缘关系。
　　本研究旨在对广东地区开展肠炎沙门菌耐药监测和耐药菌株的分子分型研究，对2007-2013年GSS的肠炎沙门菌临床分离株进行药物敏感性检测（微量肉汤稀释法），并针对目前临床上治疗沙门菌感染主要使用喹诺酮类药物和头孢类药物，特别是Ⅱ代头孢菌素类以及Ⅲ代喹诺酮类的耐药菌株进行耐药基因PMQR的检测和PFGE、MLST分子分型，有利于我们对于临床高频用药的监测追踪，将重点监测结果及时反馈，可以更好地指导临床合理用药。获取的耐药菌株的核酸指纹基础数据，可以分析本省监测点医院腹泻病例临床分离株之间的遗传学关联性，了解其分子遗传特征，为发现肠炎沙门菌可能引起的暴发提供本底发病水平，为实验室监测、鉴定溯源及防控预警提供技术支持和数据参考，提高食源性疾病的检测和防控能力。
　　研究目的:
　　1、了解2007年-2013年广东省人群中感染肠炎沙门菌的耐药情况，绘制耐药谱，分析多重耐药特点。为指导临床医生合理选择使用抗生素，同时为预防和控制肠炎沙门菌引起的感染性腹泻的发生和流行提供科学依据。
　　2、根据耐药结果选择耐氟喹诺酮类和头孢类药物的菌株进行PMQR基因检测，了解耐药基因在广东省肠炎沙门菌中的分布，发现其流行病学规律。
　　3、对耐药肠炎沙门菌菌株进行PFGE分型和MLST分型，对菌株带型的聚集和分布规律进行分析，掌握广东省流行株型别与全球流行现况，以发现带型的流行病学规律，为监测和暴发研究提供基础。
　　研究方法:
　　1、采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法对广东省2007-2013年肠炎沙门菌进行抗生素敏感性实验，测定菌株的最小抑菌浓度（MIC值）。使用WHONET5.3进行抗生素敏感性试验数据分析，并将数值导入SPSS13.0软件进行统计分析，对2007-2013年GSS系统肠炎沙门菌的阳性检出率状况、三间分布特点，以及抗生素敏感性和多重耐药的特点进行描述性统计分析。
　　2、对耐头孢类和氟喹诺酮的菌株进行PMQR质粒基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、aac(6')-Ib-cr)检测，分析介导肠炎沙门菌对氟喹诺酮耐药的质粒基因在广东省的分布情况及其对MIC值的影响。MIC几何均数值的组间比较采用变量变换后的非配对t检验，计数资料的组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　3、参照国际PulseNet的沙门菌PFGE分子分型标准操作方案，对上述耐头孢类和氟喹诺酮类的肠炎沙门菌进行分子分型。菌株先经限制性内切酶消化，脉冲场凝胶电泳后，使用凝胶成像分析系统生成图像条带，BioNumerics软件对图像条带进行识别、处理，H9812菌株作为标准分子量进行校准。选择非加权配对算术平均法进行条带的聚类分析，根据分析结果使用统一命名规则对条带进行编号，建立耐药肠炎沙门菌的PFGE分子分型数据库。
　　4、参考PulseNet推荐的沙门菌7个位点(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA) MLST标准操作方案，对反应体系和检测步骤进行相关的优化，测序后根据分析结果使用既定命名规则对ST型别进行编号，建立数据库。结合菌株的流行病学资料，对MLST型别的亲缘进化关系、分布规律以及与耐药谱的关系进行分析，同时与PFGE分型进行比较，综合评价MLST的分型能力和实际应用价值。
　　研究结果:
　　1、2007-2013年共收集散发腹泻病例63687例，分离得到肠炎沙门菌菌株386例（检出率6.06％）。菌株分离主要来源于广州、东莞，并以珠三角城市群为中心，呈散发趋势，各地区检出率无显著性差异。在分离的386株散发病例肠炎沙门菌中，男女比例为1∶0.698;各个年龄段均有感染的可能性，总体以1～4岁的儿童病例为主，占总数的35.23％(136/386)，中青年组（18～60岁）病例排行第二，占总数的23.83％(92/386)。全年均可检出，高峰期为6～10月。
　　2、MIC结果显示，肠炎沙门菌对八种抗生素均可能产生耐药。喹诺酮类药物中以第一代喹诺酮类药物萘啶酸(NAL)耐药率最高85.23％(329/386)，MIC50值为128μg/ml;以第二代头孢菌素类的头孢西丁耐药率最低(0.52％，2/386)，MIC50值为2μg/ml，此外，四环素(TET)的耐药率也较高(30.83％，119/386)，MIC50值为2μg/ml。386株菌共有27个耐药谱，以单一耐萘啶酸(NAL)(43.78％，169/386)为主，其次耐四环素加萘啶酸(TET+NAL)(15.03％,58/386)。有63株菌株对3种及3种以上的抗生素耐药，占菌株总数的16.32％(63/386)。
　　3、根据MIC药敏结果筛选出71株耐氟喹诺酮类药物和耐头孢类药物的肠炎沙门菌的PMQR基因检测结果为:总体质粒携带率为63.38％(45/71)，其中35株仅携带一种PMQR基因(49.30％，35/71);9株携带两种PMQR基因(12.68％，9/71);1株携带四种PMQR基因(1.41％，1/71)。oqxAB检出率最高，达40.85％(29/71)，其次为qnrC(9.86％，7/71)，qepA未检出。携带PMQR质粒与未携带PMQR质粒的菌株在氯霉素(CHL)和磺胺类药物(TMP/SMZ)的MIC几何均数值有统计学差异，携带PMQR质粒组多重耐药的比例(75.56％，34/45)高于未携带PMQR质粒的菌株比例。
　　4、71株耐药肠炎沙门菌XbaⅠ酶切的聚类分析可分为两个大聚类，PFGE图谱的相似值为56％-100％，共分为PFGE-XbaⅠ1-35型。最大的型别有8株菌，最小的为1株。
　　5、71株耐药肠炎沙门菌的MLST分型均为同一型别，等位基因序为aroC5、dnaN2、hemD3、hisD7、purE6、sucA6、thrA11;等位基因谱为ST11型，属于eBG4型。这说明广东省耐药肠炎沙门菌的优势序列型均为ST11型。
　　结论:
　　1、肠炎沙门菌为广东省第二大优势血清型，主要易感人群为1-4岁的幼儿，夏秋季高发，病例集中分布于珠三角地区。药敏结果显示萘啶酸(NAL)耐药率最高，多重耐药率为16.32％。
　　2、对于耐药菌株的PMQR质粒基因检测结果说明携带PMQR质粒的菌株对比未携带质粒的菌株耐药性更高，且更易发生多重耐药现象。
　　3、MLST的分子分型结果表明，在沙门菌同一血清型内各菌株看家基因碱基序列的高度保守，而PFGE则提示肠炎沙门菌的分化程度不高;对于肠炎沙门菌来说，MLST和PFGE的分辨力均较低，还需用其他分辨力更高的分子分型方法。

目录

摘要

前言

第一章 2007-2013年广东省肠炎沙门菌耐药监测情况

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二章 耐药菌株的PMQR质粒基因的检测

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第三章 耐药肠炎沙门菌的分子分型研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文小结

参考文献

附录

硕士期间论文发表情况

致谢

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