脂质运载蛋白-2通过miR-138促心肌细胞凋亡的机制研究及其在心衰中诊断价值的Meta分析

摘要

目的：
　　1.以小鼠心脏H9C2细胞和HL-1细胞作为研究对象，运用分子生物学技术如实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹实验(Western blot)、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)、流式细胞凋亡法(Annexin)观察LCN-2通过影响miR-138，对心肌细胞凋亡的作用。进一步揭示LCN-2在心力衰竭方面的分子通路，为LCN-2在心衰的诊断和治疗上的应用提供分子生物学依据。
　　2.采用Meta分析评估LCN-2在急性和慢性心力衰竭患者中的表达水平及特点，进一步揭示LCN-2在急性和慢性心力衰竭方面的诊断价值，为LCN-2在心衰诊断和治疗方面的应用提供循证医学依据。
　　方法：
　　第一部分 LCN-2通过miR-138促心肌细胞凋亡的机制研究
　　一、缺氧状态下LCN-2和miR-138的表达
　　1、LCN-2在缺氧心肌细胞模型中的表达
　　1）干预48小时，采用qRT-PCR检测两组细胞中LCN-2的mRNA含量;采用WB检测两组细胞中LCN-2蛋白表达;2）缺氧组观察72小时，用WB检测各时间点（0、24、48、72小时）LCN-2的含量。
　　检测细胞:H9C2细胞（来源于胚胎期大鼠心脏组织的亚克隆细胞系的心肌）和HL-1细胞（来源于AT-1小鼠心房肿瘤组织的心肌）。
　　2、miR-138在缺氧心肌细胞模型中的表达
　　1）干预24小时，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测两组细胞中miR-138的含量;2）缺氧组观察72小时，用qRT-PCR检测各时间点（0、24、48、72小时）miR-138含量。
　　检测细胞:H9C2细胞和HL-1细胞。
　　二、改变LCN-2和miR-138表达对心肌细胞凋亡的影响
　　1、敲除LCN-2对心肌细胞增殖和凋亡的作用
　　1）采用WB检测两组LCN-2蛋白表达;2）缺氧条件下观察96小时，采用MTT检测细胞生存活性;3）缺氧条件下暴露48小时，采用Annexin检测细胞凋亡情况;4）采用WB检测缺氧条件下活化的Caspase-3蛋白表达。
　　检测细胞:H9C2细胞和HL-1细胞。
　　2、miR-138对缺氧心肌细胞增殖和凋亡的作用
　　1）缺氧条件下观察96小时，采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞生存活性;2）缺氧条件下暴露48小时，采用流式细胞凋亡试剂盒(AnnexinⅤ-FITC/PI)检测细胞凋亡情况;
　　3）采用蛋白免疫印迹实验(Western blot，WB)检测缺氧条件下活化的Caspase-3蛋白表达。
　　检测细胞:H9C2细胞和HL-1细胞。
　　三、LCN-2和miR-138作用位点的相关研究
　　1、LCN-2和miR-138结合位点的确定
　　1）分别将miR-138质粒和空白质粒转染到心肌细胞中;2）分别将野生型Lcn2-3'UTR和突变型Lcn2-3'UTR全长序列构建双荧光素酶报告载体，转染到上述心肌细胞中，检测荧光素酶相对活力。3）上述心肌细胞转染48小时后，用qRT-PCR检测两组细胞中LCN-2的mRNA含量;4）采用WB检测两组LCN-2蛋白表达;5）采用免疫荧光法检测两组LCN-2含量。
　　检测细胞:H9C2细胞和HL-1细胞。
　　2、LCN-2对过表达miR-138心肌细胞增殖和凋亡的作用
　　1）采用WB检测心肌细胞中LCN-2蛋白表达。2）缺氧条件下观察96小时，采用MTT检测细胞生存活性;3）缺氧条件下暴露48小时，采用Annexin检测细胞凋亡情况;4）采用WB检测缺氧条件下活化的Caspase-3蛋白表达
　　检测细胞:H9C2细胞和HL-1细胞。
　　第二部分 LCN-2在急、慢性心力衰竭中诊断价值的Meta分析
　　1.两名研究者在线检索PubMed、Embase、Cochrane等数据库中与“LCN-2、NGAL、急、慢性心衰”相关的文献，根据文献纳入和排除标准进行筛选，提取LCN-2值、年龄、国籍、随访时间、心功能分级等文献数据。采用QUADAS-2工具进行文献质量评价。使用Revman5.2软件进行统计分析;
　　2.根据文献异质性（I2值)选择固定效应分析模型或随机效应分析模型，采用年龄、地区、心功能等亚组分析探索异质性的来源;
　　3.按顺序逐一剔除急性和慢性心力衰竭中的每一篇文献进行敏感性分析，评估剔除文献前后合并效应量的变化。
　　结果：
　　第一部分 LCN-2通过miR-138促心肌细胞凋亡的机制研究
　　一、缺氧状态下LCN-2和miR-138的表达
　　1、缺氧心肌细胞中LCN-2水平较正常氧组显著上升;缺氧心肌细胞的LCN-2含量随时间呈逐渐下降的趋势
　　2、缺氧的心肌细胞中miR-138水平较正常氧组显著下降;缺氧心肌细胞的miR-138含量随时间呈逐渐上升的趋势。时间依赖性。
　　二、改变LCN-2和miR-138表达对心肌细胞凋亡的影响
　　1、下调LCN-2能够增强心肌细胞活力，抑制细胞凋亡
　　2、miR-138过表达能够促进心肌细胞增殖，抑制心肌细胞凋亡。
　　三、LCN-2和miR-138作用位点的相关研究
　　1、miR-138有7个保守的核苷酸序列与LCN-2的3，UTR端互补配对;LCN-2是miR-138直接结合调控的靶蛋白。
　　2、上调LCN-2可以抑制心肌细胞活力，促进细胞凋亡;miR-138可以抑制LCN-2促细胞凋亡的趋势。
　　第二部分 LCN-2在急、慢性心力衰竭中诊断价值的Meta分析
　　1、急性心衰
　　1)纳入6篇文献共826名参与者，其中实验组（急性心衰合并MACEs）291人，对照组（急性心衰无MACEs）535人。
　　2)采用随机效应模型发现实验组的LCN-2水平高于对照组(SMD=25.29，95％CI=7.77-42.8，P＜0.05，I2=56％)。采用地区亚组分析发现，欧美人群中实验组的LCN-2水平高于对照组(SMD=17.21，95％CI=6.84-27.57，P＜0.05，I2=21％)。
　　3)剔除每一篇文献前后的合并效应量均无显著变化，说明本部分研究数据敏感性较好，得出的结果较稳定。
　　2、慢性心衰
　　1)纳入6篇文献共627名参与者，其中实验组（慢性心衰）409人，正常对照组218人。
　　2)采用随机效应模型发现实验组的LCN-2水平高于对照组(SMD=59.99，95％CI=29.67-90.31，P＜0.001，I2=94％)。采用年龄亚组分析发现，40-60岁人群中实验组的LCN-2水平高于对照组(SMD=47.01，95％CI=29.74-64.29，P＜0.001，I2=47％);60-70岁人群中实验组的LCN-2水平高于对照组(SMD=21.45，95％CI=11.10-31.79，P＜0.001，)2=40％)。采用心功能亚组分析发现，心功能Ⅳ级的LCN-2含量较Ⅱ+Ⅲ级升高(SMD=38.99，95％CI=3.97-74.00，P＜0.05);心功能Ⅲ级的LCN-2含量较心功能Ⅱ级升高(SMD=16.75，95％CI=1.33-32.17，P＜0.05);心功能Ⅱ+Ⅲ级的LCN-2含量较心功能Ⅰ级升高(SMD=25.12，95％CI=13.90-36.34, P＜0.001)。
　　3)剔除每一篇文献前后的合并效应量均无显著变化，说明本部分研究数据敏感性较好，结果稳定。
　　结论：
　　1、在缺氧心肌细胞中，LCN-2水平显著上升，miR-138水平显著下降;
　　2、下调LCN-2能够通过升高miR-138，增强心肌细胞活力，抑制细胞凋亡;上调LCN-2能够通过降低miR-138，抑制心肌细胞活力，促进细胞凋亡;
　　3、miR-138可以与LCN-2的3'UTR端互补配对，LCN-2是miR-138直接结合调控的靶蛋白;
　　4、急性心衰合并MACEs人群的LCN-2水平高于急性心衰无MACEs人群，慢性心衰患者的LCN-2水平高于健康人群，LCN-2可以作为预测急性心衰合并MACEs事件和辅助诊断慢性心衰的指标。

目录

摘要

前言

实验流程图

第一部分 LCN-2通过miR-138促心肌细胞凋亡的机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 LCN-2在急性和慢性心力衰竭中诊断价值的Meta分析

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文结论

参考文献

中英文缩略词表

SCI投稿(一)

攻读学位期间成果

致谢

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