去甲基化药物治疗较高危骨髓增生异常综合征患者的疗效预测及耐药相关机制的研究

摘要

MDS是一组高度异质性的恶性疾病，去甲基化治疗虽是其治疗史上的里程碑，但尚存在很多不足，我们试图通过从甲基化药物的临床资料、相关代谢基因水平及凋亡基因水平、基因突变等方面，寻找可能为MDS患者提供可预测去甲基化疗效以及患者生存期的指标、探索其耐药的相关机制。
　　本论文分三部分:
　　第一部分:去甲基化药物治疗MDS患者的临床疗效预测指标
　　目的:
　　回顾性分析我院接受去甲基化药物治疗的骨髓增生异常综合征患者，探讨其疗效及生存期与临床特征的关系。
　　方法:
　　回顾性分析我院自2009年11月至2013年11月接收去甲基化药物治疗2个疗程以上的60例初诊骨髓增生异常综合征患者（共计接受537个疗程，中位疗程数为7疗程，2-23疗程）。收集患者所有的临床资料，包括患者用药方案、年龄、性别、初诊时诊断分型、IPSS评分、细胞遗传学及患者用药前血小板数值、治疗第一疗程后血小板数值、治疗第二疗程后血小板数值，同时为进一步探索患者血小板增倍与总生存时间的关系，我们对所有患者进行2年以上的生存期随访，每1-3月电话随访一次，直至患者死亡或失访。采用SPSS20.0统计分析软件包进行数据的统计分析，接受去甲基化治疗进行疗效判定的有效组与无效组间的患者分布特征使用卡方检验(Pearson Chi-square test)或费舍尔精确检验(Fisher's exact test)，而两组间的生存时间采用Kaplan-Meier法进行检验。
　　结果:
　　1、60例初诊MDS患者接受去甲基化药物治疗，共计接受573个疗程，中位疗程数为7个疗程（2-23疗程）。该60例患者中，平均中位年龄为59岁(33-79岁），其中18例患者接受阿扎胞苷，42例患者接受地西他滨。基于WHO诊断标准的RAEB-Ⅰ患者16例，RAEB-Ⅱ患者33例，骨髓原始细胞＜30％的急性髓系白血病患者1例。根据IPSS(International Prognosis Scoring System)评分标准，38例患者细胞遗传学好，12例患者细胞遗传学差，余10例患者中等。根据MDS国际工作组疗效评判标准，33例患者治疗有效，27例患者治疗无效，总反应率为55％。统计学分析发现，阿扎胞苷与地西他滨间的疗效相当(P=0.234)。年龄(P=0.069)，性别(P=0.759)，IPSS评分(P=0.115)及细胞遗传学(P=0.839)均与去甲基化药物的疗效无关，但初诊时诊断为较低危MDS患者(RCMD)的疗效则显著低于较高危患者(P=0.033)。
　　2、在这60例患者中，18例患者接受去甲基化治疗2个疗程后达到血小板增倍，其中15患者治疗有效，即在接受去甲基化药物2个疗程后达到血小板增倍的患者总反应率为83.33％。且在该18例患者中，用药前血小板中位数值为39×109/L[标准差(standard deviation，SD)55×109/L，范围:10-174×109/L]，接受治疗1个疗程后增长到74×109/L(SD:118×109/L，range:18-391×109/L)，2个疗程后增长至164×109/L(标准差:168×109/L，范围:25-730×109/L)（图1）。而其他42例未达到血小板增倍的患者中，2个疗程后18例患者治疗有效，总反应率为42.86％。进行统计学分析发现，接受去甲基化药物治疗2疗程后，发生血小板增倍的患者有效率明显高于未发生者(83.33％ VS42.86％，P=0.004)，即2个疗程后血小板达到增倍是去甲基化治疗有效的一项临床预测指标。
　　3、在接受地西他滨治疗的患者中，血小板增倍的患者生存期更长（中位生存期，38月VS14月， P=0.021），而单独接受阿扎胞苷的患者中，血小板增倍的患者生存期并未发生变化。但综合年龄、性别、IPSS评分、是否移植进行多因素生存分析发现，无论是地西他滨抑或是阿扎胞苷，血小板增倍都是独立的与生存期相关的预后因素（中位生存期，24月VS16月， P=0.025），此外，IPSS评分亦与生存期相关(P=0.035)。
　　结论:
　　1、接受去甲基化药物治疗2疗程后血小板达到增倍的患者对去甲基化药物反应好
　　2、接受去甲基化药物治疗2疗程后血小板达到增倍的患者生存时间更长
　　第二部分:地西他滨相关代谢基因表达水平在其产生原发性耐药及继发性耐药的机制研究
　　目的:
　　探索接受地西他滨治疗的MDS患者代谢基因表达水平与其产生原发性耐药及继发性耐药的关系。
　　方法:
　　我们选用37例接受地西他滨治疗的骨髓增生异常综合征患者（34例）及急性髓系白血病患者（3例），其中31例患者（包括28例MDS患者及3例AML患者）至少接受了2个疗程以上的达珂规范治疗。在此28例MDS患者中，根据国际MDS工作组IWG疗效标准，14例患者接受地西他滨治疗有效，14例患者治疗无效，即14例患者产生原发性耐药。其中，在治疗有效的患者中，5例患者达到不少于8个疗程的持续骨髓完全缓解(continued mCR)，5例患者在治疗过程中丧失疗效或复发，即5例患者产生继发性耐药。在此研究中，我们共收集该31例患者的44份骨髓或外周血样本，27对样本。其中28份样本取于该28例MDS患者接受地西他滨治疗前，5份样本取于5例患者复发时，5份样本取于5例持续骨髓完全缓解患者第八疗程时，6份标本来自3例AML患者初诊时与复发时。我们使用QT-PCR方法监测此28例患者达珂治疗前的相关代谢基因(包括hENT1，dCK与CDA)及凋亡基因(BCL2L10)的mRNA水平，从而比较反应组与未反应组的基因水平。此外，我们继续监测5例持续CR患者的第4次mCR后、第8次mCR后及8例复发患者（包括另3例复发的AML患者）复发时的mRNA水平，比较二者基因水平有无差别。
　　结果:
　　1、在达珂治疗无效的患者中，hENT1基因的表达水平明显低于治疗有效的患者(P=0.004)，而其他基因，包括CDA、DCK及BCL2L10基因表达水平无明显差别(CDA，P=0.201;DCK，P=0.687; BCL2L10，P=0.201)，这表明hENT1基因表达水平是MDS患者接受地西他滨治疗后产生原发性耐药的潜在预后因子。
　　2、地西他滨的代谢相关基因（DCK基因，CDA基因，hENT1基因）及凋亡相关基因（BCL2L10基因）表达水平在男性、女性分布表达水平均无差别，分别为96.70±36.3 vs128.72±36.3(P=0.157)，2048.69±1254.57 vs1679.65±1555.03(P=0.295),191.91±66.68 vs217.75±94.38(P=0.295)及1.19±1.21 VS1.45±0.75(P=0.176)，这意味着性别与代谢基因表达分布水平无关。
　　3、在疾病丧失疗效时或复发时，DCK基因表达水平较初诊时明显降低(P=0.012)，而其他基因表达水平，包括CDA基因、hENT1基因及BCL2L10基因表达水平，与初诊时相比较并无明显差异，P值分别为CDA(P=0.484)，hENT1(P=0.208)及BCL2L10(P=0.093)，而持续mCR的患者DCK基因表达水平较初诊时并无明显差别(P=0.222)。
　　结论:
　　1、hENT1基因表达水平是MDS患者接受地西他滨治疗后产生原发性耐药的潜在预后因子。
　　2、DCK基因表达水平是MDS患者及AML患者接受地西他滨治疗后产生继发性耐药的潜在预后因子。
　　第三部分:TET2、ASXL1基因突变及TP53基因突变与地西他滨产生耐药的机制研究
　　目的:探索接受地西他滨治疗的MDS患者TET2基因突变及ASXL1基因突变与其疗效间的关系。
　　方法:我们选用53例接受去甲基化治疗2疗程以上的患者，收集该53例患者治疗前的53份骨髓或外周血样本，进行二代测序并分析基因突变结果，比较TET2基因突变、ASXL1基因突变及TP53基因突变与去甲基化药物疗效的关系及与患者生存期之间的关系。
　　结果:
　　1、53例患者中、接收去甲基化治疗有效的患者为29例，总反应率为53.7％，其中共有14例患者发生TET2基因突变，突变发生率为26.41％， ASXL1基因突变存在于9例患者中，突变发生率为16.98％，TP53基因突变存在于7例患者中，突变发生率为。所有突变一例为纯合突变，其他均为杂合突变，包括点突变，错义突变，无义突变，移码突变，插入突变等。其中，3例患者同时含有TET2基因、ASXL1基因两种突变，其中1例患者同时含有三种基因突变。
　　2、在这发生TET2基因突变的14例患者中，7例患者治疗有效，7例患者治疗无效，无明显统计学意义。而在发生ASXL1基因突变的9例患者中，2例患者治疗有效，7例患者治疗无效，进行统计学分析发现，ASXL1可能是地西他滨治疗疗效差的一个潜在预后因子，不过仍需扩大样本量来进一步证实。TP53基因突变亦与疗效无关，但生存分析发现其与患者生存期短密切相关(P=0.007)，而TET2基因突变(P=0.513)及ASXL1基因突变(P=0.110)则与生存期无关。
　　结论:
　　1、ASXL1基因突变可能是MDS患者接受去甲基化治疗疗效较差的因素
　　2、TP53基因突变可能是MDS患者生存期短的预后因素.

目录

摘要

前言

第一部分 去甲基化药物治疗MDS患者的临床疗效预测指标

一、病例与方法

二、统计学方法

三、实验结果

第二部分 代谢基因表达水平在地西他滨耐药机制中的研究

一、主要实验仪器及试剂

二、实验步骤及方法

三、统计学分析

四、实验结果

第三部分 去甲基化药物治疗MDS患者的临床疗效预测指标

一、主要实验仪器及试剂

二、实验方法

二、统计学分析

三、实验结果

讨论

全文小结

参考文献

致谢

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