miR-203和ZEB2直接相互作用抑制EMT信号通路减少肺腺癌化疗耐药

摘要

目的：
　　1.研究过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性的影响
　　2.用miR-203 inhibitor抑制miR-203后，稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性的影响
　　3.过表达/抑制miR-203对ZEB2和EMT标志物的影响
　　4.MiR-203对ZEB2的调控机制
　　5.ZEB2干扰后的A549及SPCA-1细胞对顺铂药敏感性影响
　　6.ZEB2干扰后对miR-203表达的影响
　　7.ZEB2对miR-203的调控机制
　　内容与方法：
　　1、稳定过表达miR-203肺腺癌细胞株的构建
　　1)用miR-203慢病毒感染A549和SPCA-1细胞，构建稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞株
　　2)提取稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞的总RNA
　　3)使用Clontech试剂盒将RNA逆转录为cDNA
　　4)运用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒检测感染miR-203慢病毒后肺腺癌细胞株A549及SPCA-1中miR-203的表达水平，以鉴定稳定过表达miR-203的细胞株是否构建成功
　　2、用MTT方法检测过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响
　　3、miR-203 inhibitor对稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响
　　1)将miR-203 inhibitor瞬转入已经稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中;
　　2)提取瞬转miR-203 inhibitor前后细胞中的总RNA;
　　3)使用Clontech试剂盒将RNA逆转录为cDNA;
　　4)运用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR，检测miR-203 inhibitor对miR-203表达的抑制效率;
　　5)用MTT方法检测瞬转miR-203后，稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性;
　　4、过表达miR-203对ZEB2和EMT相关蛋白的影响
　　1)提取稳定过表达miR-203前后的A549和SPCA-1细胞的蛋白并测浓度;
　　2)Western blot检测过表达miR-203前后A549和SPCA-1细胞中ZBE2、E-cadherin、N-cadherin的表达水平;
　　5、miR-203 inhibitor对稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中ZEB2表达的影响
　　1)将miR-203 inhibitor瞬转入稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中;
　　2)提取瞬转miR-203 inhibitor前后细胞中的蛋白并测浓度;
　　3)Western blot检测瞬转miR-203 inhibitor后，稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞中ZEB2的变化。
　　结果：
　　1、稳定过表达miR-203肺腺癌细胞株的构建
　　用miR-203慢病毒颗粒感染肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞，使其过表达miR-203，并通过荧光定量Q-PCR方法鉴定其过表达效率。结果显示，在肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞中，与阴性对照组相比，转染miR-203慢病毒的细胞中miR-203的表达水平明显升高(P＜0.05)，说明过表达miR-203的肺腺癌细胞株构建成功，可用于后续实验。
　　2、过表达miR-203对A549和SPCA-1细胞顺铂化疗敏感性的影响
　　用MTT方法检测过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂化疗的药物剂量反应，绘制出药物剂量反应曲线，统计分析显示，在A549和SPCA-1细胞株中，过表达miR-203后，细胞对顺铂更敏感，IC50值均降低，且两个不同处理组之间存在显著性差异(P＜0.001)。说明过表达miR-203可增加肺腺癌细胞对顺铂化疗的敏感性，降低肺腺癌细胞对顺铂的耐药。
　　3、miR-203 inhibitor可逆转稳定过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性
　　1)为了进一步研究miR-203对肺腺癌细胞对药物化疗的影响，我们在稳定过表达miR-203的肺腺癌细胞中，再次转染miR-203 inhibitor，并通过荧光定量Q-PCR检测miR-203在肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞中的表达，与稳定过表达miR-203组细胞相比，miR-203 inhibitor使这些细胞中miR-203的表达水平明显降低了(P＜0.05)，说明miR-203 inhibitor能够抑制miR-203的表达。
　　2)为了从另一个方向研究miR-203对肺腺癌细胞对药物化疗的影响，我们在稳定过表达miR-203的A549细胞中，用miR-203 inhibitor抑制了miR-203的表达，并通过MTT方法检测A549细胞对顺铂的敏感性，绘制出A549对顺铂的药物剂量反应曲线，发现转入miR-203 inhibitor后，稳定过表达miR-203的A549和SPCA-1细胞对DDP的敏感性降低了，IC50值增加了，说明miR-203 inhibitor逆转了稳定过表达miR-203后A549和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性，下调miR-203的表达能够增加肺腺癌细胞对顺铂耐药。
　　4、miR-203对ZEB2和EMT相关蛋白的影响
　　研究已经表明，ZEB2是调控细胞上皮间质转化的一个重要因子，且EMT相关蛋白在肿瘤的耐药中亦起着重要的作用，为了寻找miR-203调控肺腺癌细胞化疗敏感性的机制，过表达miR-203后，通过Western Blot法检测肺腺癌细胞中ZEB2和EMT相关蛋白的变化。结果显示，在肺腺癌A549和SPCA-1细胞株中，高表达miR-203可以抑制转录因子ZEB2和间质标志物N-cadherin的表达，促进上皮标志物E-cadherin表达。反之，当在稳定过表达miR-203的细胞中导入miR-203 inhibitor后，ZEB2的表达则升高了。说明miR-203能够介导ZEB2调控EMT相关蛋白。
　　5、miR-203靶向作用于ZEB2的3'UTR
　　1)我们用TargetScan在线软件预测miR-203的靶基因，发现ZEB2可作为候选靶基因，随后用UCSC Genome Bioinformatic获得候选靶基因ZEB2的3'UTR序列，从miRBase数据库找到成熟hsa-miR-203的序列，然后用RNAhybrid软件预测出miR-203于ZEB23'UTR的结合位点。
　　2)我们成功构建了psicheck-2/ZEB2 wt3'UTR质粒和psicheck-2/ZEB2 mut3'UTR质粒，分别与miR-203 mimics和inhibitor共转染293T细胞，转染48h后检测荧光素酶活性。结果显示，psicheck-2/ZEB2 wt3'UTR质粒和miR-203mimics一起转染时，可明显降低荧光素酶的活性，差异具有统计学意义(P＜0.001)，而与miR-203 inhibitor共转染可显著增强荧光素酶活性(P＜0.001)。突变质粒psicheck-2/ZEB2 mut3'UTR分别与miR-203 mimics和inhibitor共转染后，与psicheck-2载体组相比，荧光素酶活性没有明显变化(P＞0.05)。这些结果表明，miR-203能够与ZEB2的3'UTR端特异性结合。
　　结论：
　　1、过表达miR-203增加肺腺癌A549细胞和SPCA-1细胞对顺铂的化疗敏感性。
　　2、miR-203 inhibitor可逆转miR-203引起的肺腺癌细胞对顺铂的化疗敏感。
　　3、过表达miR-203抑制ZEB2和EMT相关蛋白N-cadherin的表达，促进E-cadherin的表达。
　　4、miR-203 inhibitor可逆转过表达miR-203引起的ZEB2上调。
　　5、miR-203直接靶向作用于ZEB2的3'UTR抑制ZEB2的表达。
　　6、干扰ZEB2后使肺腺癌细胞对顺铂的化疗敏感性增加.
　　7、干扰ZEB2使肺腺癌细胞中miR-203的表达升高.
　　8、ZEB2与miR-203的启动子区域结合，均可作为肺腺癌治疗的新的靶点，用以指导非小细胞肺癌的精准治疗和个体化治疗。

目录

摘要

第一章 miR-203减少肺腺癌顺铂耐药的影响

前言

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、本章结论

参考文献

第二章 miR-203靶向ZEB2调控EMT信号通路

背景

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、本章结论

参考文献

第三章 ZEB2干扰后对肺腺癌顺铂耐药的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、本章结论

参考文献

第四章 ZEB2逆向调节miR-203

背景

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、本章结论

参考文献

综述 miRNA-203在恶性肿瘤中的研究进展

英文缩写词简表

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致谢

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