Cx43通过抑制EMT逆转人肺腺癌细胞A549对顺铂的获得性耐药

摘要

目的：
　　观察Cx43对人肺腺癌细胞A549的获得性耐药的影响，以及与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的关系。
　　方法：
　　采用MTT法确定耐药株，用不同浓度的顺铂（0，20，40，80，160，320μM）分别作用人肺腺癌敏感株（A549）和人肺腺癌耐顺铂耐药株（A549/CDDP）48h后测定细胞存活率，确定耐药指数。
　　1.采用Western blotting法检测A549和A549/CDDP中Cx43及EMT标志蛋白上皮钙粘附素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、转录因子Snail，Slug的表达，及干扰和过表达Cx43后EMT相关蛋白的表达。
　　2.采用SiRNA小干扰的方法下调Cx43的表达，用过表达方法上调Cx43的表达。
　　3.采用Transwell法检测A549和A549/CDDP的侵袭能力，以及干扰或过表达Cx43后细胞的侵袭能力。
　　4.采用划痕实验来检测 A549和 A549/CDDP的转移能力，以及干扰或过表达Cx43后细胞的转移能力。
　　5.统计学方法：组间数据分析采用SPSS13.0软件进行t检验。
　　结果：
　　1.耐药株的鉴定
　　M TT结果显示：A549/CDDP的IC50=311.2μM，A549的IC50=53.6μM，RI=5.8，结果显示A549/CDDP对顺铂产生了获得性耐药。
　　2.A549/CDDP细胞与A549细胞相比发生了EMT转化
　　Western blotting的结果显示与A549相比A549/CDDP细胞中的上皮标志蛋白E-cadherin的表达显著降低，而间质标志蛋白Vimentin的表达显著增强，转录因子Snail、Slug的表达也显著增强。
　　3.与A549细胞相比A549/CDDP细胞的侵袭转移能力显著增强
　　细胞侵袭转移能力的获得是EMT改变的重要标志，Transwell和划痕的实验结果表明，与A549相比A549/CDDP细胞的侵袭转移能力显著增强。
　　4.与A549细胞相比A549/CDDP细胞中Cx43的表达量显著降低
　　Western blotting结果表明，与A549相比A549/CDDP细胞中的Cx43的表达量显著降低，此差异具有统计学意义。
　　5.上调Cx43的表达可逆转A549/CDDP细胞的EMT转化
　　采用过表达技术将含目的基因的质粒（pcDNA-Cx43）与空质粒（pcDNA）分别转染进入A549/CDDP细胞中，在显微镜下观察细胞形态发现与pcDNA相比pcDNA-Cx43组过表达Cx43后细胞的形态重新变得圆润，细胞间粘附增强；Western blotting结果显示：与pcDNA相比pcDNA-Cx43组过表达Cx43后E-cadherin的表达显著增强而间质标志蛋白Vimentin的表达显著降低，转录因子Snail, Slug的表达也显著降低。
　　6.下调Cx43的表达可诱导A549细胞发生EMT转化
　　采用基因敲除技术将含目的基因的小干扰片段（siRNA-Cx43）与空质粒（NC）分别转染进入A549细胞中在，在A549细胞中沉默Cx43的表达后，Western Blottin结果显示：与NC组相比siRNA-Cx43的E-cadherin的表达显著降低而间质标志蛋白Vimentin的表达显著增强，转录因子Snail, Slug的表达也显著增强。
　　7.Cx43可调控人肺腺癌细胞的侵袭转移能力
　　Transwell实验和划痕的实验结果表明在A549/CDDP细胞中过表达Cx43后，侵袭转移能力显著降低；Transwell实验和划痕的实验结果表明在A549/CDDP细胞中沉默Cx43的表达后，侵袭转移能力显著增强。
　　8.Cx43可调控人肺腺癌细胞对顺铂的敏感性
　　结果显示，在A549/CDDP细胞中过表达Cx43后，对CDDP的敏感性显著增强；在A549细胞中干扰Cx43后，对CDDP的敏感性显著降低。以上结果均表明Cx43可调控人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。
　　结论:Cx43可调控人肺腺癌A549对顺铂的获得性耐药，可能与Cx43可抑制EMT的作用有关。

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引言

材料与方法

1 材料与仪器

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1. A549/CDDP对CDDP产生耐药性

2. A549/CDDP与A549相比发生EMT转化

3. 与A549相比A549/CDDP的侵袭转移能力显著增强

4. 与A549相比A549/CDDP中Cx43的表达量显著降低

5. 上调Cx43的表达可逆转A549/CDDP细胞的EMT转化

6. 下调Cx43的表达可诱导A549细胞发生EMT转化

7. Cx43可调控人肺腺癌细胞的侵袭转移能力

8. Cx43可调控人肺腺癌细胞对顺铂的敏感性

讨论

结论

致谢

参考文献

附录A主要英文缩略词表

附录B常用试剂配制方法

附录C个人简历及论文发表

附录D综述: 缝隙连接和上皮间质转化与肿瘤细胞耐药性产生的相关性研究