miR-101靶向调节AMPK表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞自噬及促进其增殖

摘要

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是全球范围终末期肾脏病(End stagerenal disease，ESRD)的最主要死亡原因之一，其患病率日益增加。
　　肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells，GMCs)是肾脏重要的固有细胞之一，具有维持肾小球系膜区细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)代谢平衡的重要作用。
　　自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，对维持细胞内环境稳定具有重要作用。DN时，氧化应激、内质网应激、转化生长因子-β1、肾素-血管紧张素系统激活、缺氧等肾脏损伤因素在损伤肾脏的同时诱导细胞自噬，进而维持细胞稳态与存活，而高糖条件下可导致GMCs自噬功能受到抑制，从而加重了损伤因素对肾脏系膜细胞的损伤。然而，在糖尿病(DiabetesMellitus，DM)状态下的肾脏组织中，诱导细胞自噬的损伤因素增多，具有细胞保护作用的自噬现象不但没有代偿性增高，反而处于抑制状态，这种损伤作用增强、保护作用减弱的矛盾提示，DM状态下GMCs的自噬功能缺陷可能参与了DN的发生与发展，为我们探究DN的发病机制提供了新思路。
　　MicroRNAs是一种内源性非编码单链核苷酸，其长度约为19-25个核苷酸。microRNAs调节了细胞生长，组织分化，参与多种细胞学行为，因而与生命过程中发育、疾病密切相关。现已证实microRNA的种子序列能通过完全或几乎完全碱基互补配对的方式与靶基因mRNA3'端非编码区相结合从而引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，进而在转录后水平调节基因的表达。miR-101是众多microRNAs中的一员，近年来多有文献报道miR-101能够通过抑制肿瘤细胞的自噬反应，增加肿瘤细胞对放化疗药物的敏感性，也有报道其表达量下降能在体内或体外抑制肿瘤的生长。Chigusa Higuchi等发现，2型糖尿病患者(Type2 diabetes，T2D)血清中log10miR-101的浓度比正常糖耐量患者(Normal glucosetolerance，NGT)明显增高。miR-101在动物体内多种组织中的表达谱显示，它在胰腺组织中高表达，而T2D组血清中高表达的miR-101除了来源于胰腺组织还是可能来源于其他组织？目前还不清楚。在肿瘤细胞中，miR-101能通过负性调控靶基因（如E2H2、STMN1、RAB5A、ATG4D等）的表达抑制肿瘤细胞的自噬反应，增强其凋亡。在DN中，高糖可以抑制GMCs的自噬反应，而miR-101在T2D患者血清中的表达量升高，且它能够靶向调控自噬基因，那么miR-101在DN的GMCs中是否表达增高，能否抑制GMCs的自噬反应，从而影响DN的发生发展。
　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是真核生物中高度保守的能量感受器，广泛表达于所有类型的肾脏细胞，其磷酸化活性降低与DN的发生发展关系密切，当AMP/ATP比率升高时被激活，被认为是糖尿病治疗的有效新靶点之一。有报道证明:白藜芦醇可以通过对AMPK的激活减轻DN早期的肾脏损害。AMPK对自噬作用的调节也起到关键作用，在DN中，AMPK的活性受到抑制，GMCs的自噬功能减弱，而激活AMPK信号通路可以改善高糖诱导的GMCs自噬功能障碍。因此，高糖刺激下GMCs的AMPK磷酸化活性降低与自噬抑制有关，而激活AMPK可改善高糖刺激下系膜细胞的自噬功能。
　　本课题以小鼠肾小球系膜细胞株SV40 Mes作为研究对象，首先通过体外培养SV40 Mes细胞观察高糖对SV40 Mes细胞自噬、增殖能力及miR-101表达水平的影响，然后行双荧光素酶检测验证AMPK是否为miR-101的直接靶基因，利用qRT-PCR、Western blot法分别检测转染miR-101对SV40 Mes细胞AMPK mRNA及蛋白水平的影响。最后研究高糖条件下miR-101对SV40 Mes细胞自噬、增殖能力的影响，旨在为DN的治疗提供理论依据并寻找新思路。
　　本课题由以下两个部分的研究组成:
　　第一部分 高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞自噬、增殖及miR-101表达量的关系，验证小鼠系膜细胞存在miR-101对AMPK的直接调控关系
　　目的：
　　1.观察高糖对小鼠系膜细胞株SV40 Mes自噬、增殖能力及miR-101表达量的影响以及三者之间的关系;
　　2.验证SV40 Mes细胞中存在miR-101对AMPK的直接调控关系。
　　方法：
　　1.细胞培养:采用含10％胎牛血清的1640低糖培养基，于37℃、5％ CO2培养箱内传代培养小鼠肾小球系膜细胞株SV40 Mes。
　　2.用高糖(30mM)分别干预SV40 Mes0、24、48、72h，同时设对照组甘露醇组(30mM)。分组:正常糖组NG、甘露醇组Man、高糖组HG以及高糖干预时间梯度组:HG0h、HG24h、HG48h、HG72h共7组。检测指标:a、用WB测各组细胞胞质型微管相关蛋白1轻链3(Cytosolic truncated form of LC3，LC3BⅠ)、自噬体膜型微管相关蛋白1轻链3(Autophagosomal membraneassociated form of LC3，LC3BⅡ)、AMPK、p-AMPK、PCNA的表达水平;b、用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖率;c、用qRT-PCR测各组细胞miR-101的表达水平。
　　结果：
　　1.高糖环境下SV40 Mes细胞自噬体形成标志蛋白LC3B的自噬水平随着刺激时间延长逐渐降低;HG72h SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平最低。干预72h后，HG组SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平较NG组显著降低(P＜0.05);NG组与Man组SV40 Mes细胞LC3B蛋白的自噬水平未见明显异常(P＞0.05)。
　　2.高糖刺激72小时(HG72h)后，SV40 Mes细胞内PCNA蛋白的含量较HG0h显著增多(P＜0.05);高糖刺激其他时间点SV40 Mes细胞内PCNA蛋白的含量无明显差异。干预72h后，HG组SV40 Mes细胞内PCNA的含量较正常组显著增高(P＜0.05); NG组与Man组SV40 Mes细胞内PCNA的含量未见统计学差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.高糖抑制SV40 Mes细胞自噬相关蛋白的表达，其作用与渗透压无关;可见，在DM状态的肾脏中，葡萄糖毒性损伤了GMCs的自噬功能。
　　2.高糖诱导SV40 Mes细胞内PCNA蛋白表达量增加，其作用与渗透压无关;高糖促进SV40 Mes细胞的增殖。
　　3.高糖使SV40 Mes细胞内miR-101的表达量增加，其作用与渗透压无关。
　　4.在高糖诱导SV40 Mes细胞内miR-101表达量增加中，自噬减弱、增殖能力增强与miR-101增加有关。
　　5.高糖诱导SV40 Mes细胞内AMPK的蛋白表达水平与miR-101的表达量呈负相关。
　　6.miR-101的种子序列能与AMPK-3'UTR直接结合并降低AMPK mRNA及蛋白的表达水平。
　　7.miR-101可能通过调控AMPK的表达抑制SV40 Mes细胞自噬、促进其增殖。
　　第二部分 验证miR-101调控SV40 Mes细胞的自噬、增殖能力
　　目的：
　　证明miR-101能调控高糖条件下SV40 Mes细胞的自噬、增殖能力。
　　方法：
　　1.细胞培养:同第一部分。
　　2.miR-101抑制高糖环境下SV40 Mes细胞的自噬反应。分组:NG、HG、miR-101-mimic+HG、 mimic-control+HG、 miR-101-inhibitor+HG、inhibitor-control+HG共6组。检测指标:a、用透射电子显微镜观察各组细胞的自噬体形态并计数;b、用WB测各组细胞LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白的表达水平。
　　结果：
　　1.加入高糖后显示:miR-101-mimic组SV40 Mes细胞的自噬体形成标志蛋白LC3B自噬水平较高糖组明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05);而miR-101-inhibitor组LC3B蛋白自噬水平比高糖组高，差异有统计学意义。
　　2.在透射电子显微镜下，加入高糖后miR-101-mimic转染组SV40 Mes细胞内自噬体（以包含未消化细胞质内容物的特殊双膜结构为特征）个数明显减少，具有统计学意义;miR-101-inhibitor转染组细胞内自噬体个数最多。
　　3.SV40 Mes细胞在高糖条件下，miR-101-mimic组的PCNA蛋白含量较高糖组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05);而miR-101-inhibitor组PCNA蛋白含量比高糖组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.用CCK8法检测高糖条件下SV40 Mes细胞增殖水平，加入高糖后，miR-101-mimic转染组细胞增殖水平比高糖组明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05);而miR-101-inhibitor转染组细胞的增殖水平最低。
　　结论：
　　miR-101能抑制高糖条件下SV40 Mes细胞的自噬反应，促进其增殖能力。

目录

摘要

前言

第一章 高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞自噬、增殖及miR-101表达量的关系，验证小鼠系膜细胞存在miR-101对AMPK的直接调控关系

第一节 实验材料

第二节 实验方法与步骤

第三节 实验结果

第四节 讨论

第二章 验证miR-101调控SV40 Mes细胞的自噬、增殖能力

第一节 实验材料

第二节 试验方法与步骤

第三节 实验结果

第四节 讨论

全文小结

参考文献

附录

攻读学位期间成果

致谢

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