精氨酸-壳聚糖/DNA纳米粒控释PELA微球的制备及成骨诱导效能的研究

摘要

目的:
　　构建精氨酸修饰的精氨酸-壳聚糖共聚物，并与荷负电的pBMP-2自组装凝聚成纳米级粒子，检测其纳米粒度及Zeta电位性质。体外验证纳米粒子的入胞性能。研发出内部包封有精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微球，在体外探讨PELA微球的成骨诱导效能。研究这种生物活性微球的粘弹性，表征，精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的缓释曲线，缓释出纳米粒子的生物活性，以及体外诱导成骨前体细胞的成骨分化能力。为今后骨损伤治疗的应用提供一种新方法和新思路。
　　方法:
　　1.精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的制备、表征及细胞转染性能研究
　　将L-精氨酸及壳聚糖完全溶于pH5.0的四甲基乙二胺/盐酸(TEMED/HCl)缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为激活剂及偶联剂，氮气保护下磁力搅拌室温连续反应10h，去离子水中透析4天后冷冻干燥得到精氨酸-壳聚糖(Arg-CS)复合物，并经溴化钾压片及氘代重水溶解后行傅立叶红外光谱及核磁共振1H谱验证合成物的分子结构。通过自组装凝聚法，将Arg-CS的醋酸钠/醋酸溶液与pBMP-2的NaCl溶液，以N/P为4∶1的比例快速混合，静置30min。透射电镜下检测精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的粒径及表征，马尔文纳米粒度仪分析精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒子的表面Zeta电位性质。琼脂糖凝胶电泳阻滞实验分析精氨酸-壳聚糖作为基因载体保护DNA抗DNA酶降解的能力。
　　MC3T3-E1细胞用含10％FBS的α-MEM培养基培养，待细胞达到80％融合后传代。以2×105/孔加入6孔细胞培养板，细胞融合60％后进行转染。将Arg-CS/pBMP-2纳米粒加入不含血清的α-MEM培养基中，以裸质粒DNA及壳聚糖/pBMP-2纳米粒为对照。于37℃、5％的CO2条件下孵育6h后，加入完全培养基继续培养。转染72h的细胞荧光显微镜下观察，并将细胞消化裂解，提取蛋白行western blot分析BMP-2蛋白的表达。
　　2.包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊的制备、表征及其缓释能力研究
　　根据前期研究所得的优化参数。以经典的复乳溶剂挥发法制备包封Arg-CS/pBMP-2纳米粒的PELA微囊。方法简述如下:取Arg-CS/pBMP-2纳米粒混悬液（含60μg质粒）为内水相(W1)，将300mg聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溶解于二氯甲烷中为油相(O)。将内水相加入油相，乳化10 min，形成初乳液(W1/O)。再将初乳液加入40 mL1.0％的聚乙烯醇溶液(W2)中，乳化10min，形成复乳液(W1/O/W2)，800r/min搅拌40min，彻底挥发二氯甲烷。微囊离心10min，洗涤3次收集，冷冻干燥后，扫描电镜观察。
　　取上述制备的PELA微球置于4ml二氯甲烷中充分溶解微球后，加入2mlTE缓冲液充分振荡，萃取出其内的质粒基因测定PELA微球内部包封的质粒基因的含量。同时取上述制备的PELA微球放入含1ml PBS的EP管中，置于37℃恒温箱内。在固定的时间点（2，4，8，12，16，22，28，35，42天）取出样品，EP管800r/min离心30分钟，吸出缓释液，储存于-20℃，至检测时解冻，加入适量壳聚糖酶溶液，微量分光光度计于260nm波长处测定pBMP-2含量。
　　MC3T3-E1细胞以1×105/孔接种于6孔板，用含10％FBS的α-MEM培养基培养。同时，称取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2纳米粒的PELA微球粉末分散于培养基中，以包封CS/pBMP-2纳米粒，裸pBMP-2的PELA微球为对照，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养，于3、7、10、14、18、21天换液，上清液离心，收集。按照说明书行ELISA实验检测培养液中BMP-2的分泌含量。
　　3.包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊体外成骨诱导效能的研究
　　MC3T3-E1细胞以1×105/孔接种于6孔板，称取30mg包封有Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的PELA微球分散于培养液中，分别于7天、14天用0.2％的TritonⅩ-100裂解细胞，按照ALP检测试剂盒说明书操作，酶联免疫检测仪在520nm波长读取吸光度值。取诱导21天的细胞，4％多聚甲醛固定，蒸馏水洗3遍，1％茜素红37℃下染色30min，吸去染色液，于显微镜下观察钙结节。
　　结果:
　　1.精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的制备、表征及细胞转染性能研究
　　精氨酸、壳聚糖及精氨酸-壳聚糖多聚物的红外光谱(FTIR)及1H核磁图谱(1HNMR)见图1-3。在精氨酸的红外谱图中，1558.53 cm-1处的吸收带是由于精氨酸的胍基所产生，而1474.47 cm-1处的吸收带是由羰基COO-的伸缩振动所引起。1136.63 cm-1和793.87 cm-1处的吸收带分别属于C-C-N键的伸缩振动和羰基COO-的弯曲振动。在壳聚糖的红外谱图中，在1655.66 cm-1处出现壳聚糖C=O酰基的弯曲振动带，1077.49 cm-1-1026.23 cm-1处出现吡喃环C-O键的伸缩振动带。在精氨酸-壳聚糖多聚物的红外谱图中，1543.65 cm-1及1149.80 cm-1处出现了精氨酸的特征峰，同时也出现了壳聚糖吡喃环上的C-O键的特征性伸缩振动带，而在1462.91 cm-1处出现的吸收带是因精氨酸与壳聚糖相互反应生成的酰胺键而产生。1H NMR核磁图谱进一步显示，精氨酸-壳聚糖多聚物中同时出现精氨酸与壳聚糖的特征性吸收峰。根据以上FTIR及1H NMR结果可看出精氨酸已成功接枝于壳聚糖的骨架中。
　　透射电镜可见，Arg-CS/pBMP-2纳米粒子呈球形，粒径较为均一。同时可见，裸质粒DNA电泳出加样孔，而Arg-CS/pBMP-2纳米粒能阻滞pBMP-2向阳极移动。加入不同浓度的DNA酶后，裸质粒DNA被降解，其泳道内条带基本消失，而Arg-CS/pBMP-2纳米粒泳道内的荧光亮度基本不变。由此可见，Arg-CS基因载体能成功与BMP-2质粒基因凝聚成纳米级粒子，并有效保护其内的质粒基因抗DNA酶降解。
　　MC3T3-E1细胞体外转染后72h后，Arg-CS/pBMP-2纳米粒组在荧光显微镜下有较多的细胞表达绿色荧光蛋白，壳聚糖/pBMP-2纳米粒组只有少数细胞表达弱的绿色荧光，而裸质粒DNA组只有极个别的细胞表达绿色荧光蛋白蛋白阳性(图1-7)。同时，western blot显示Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的BMP-2蛋白的表达水平明显高于壳聚糖/pBMP-2纳米粒组(p＜0.05)及裸质粒DNA组(p＜0.01)。
　　2.包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊的制备、表征及其缓释能力研究
　　扫描电镜可见微球的形态，图2-1A所示:微球呈现椭圆形或规则圆形，表面光滑、无粘连、大小分布较均匀尺寸约为43.34±15.24μm。
　　图2-1B可见，在开始2天内有累计16.46±4.73％的pBMP-2被释放，之后pBMP-2的缓释保持在相对较平稳的速率。缓慢释放2周后，pBMP-2释放速度呈现小幅加速。缓释3周后，pBMP-2缓释速度又逐渐减慢。到实验终止时（第42天），pBMP-2累积释放56.87±5.09％。可见，本研究制备的PELA微球能够满足长效缓释的要求。同时，测得包封率为67.49±0.85％。
　　包封纳米粒的PELA微球与MC3T3-E1细胞共培养后分别于3、7、10、14、18、21天行ELISA检测培养液BMP-2蛋白分泌量，由图2-1，在第7天，PELA/Arg-CS/BMP-2组的BMP-2蛋白分泌达到最高48.35±3.38 pg/ml，21天后BMP-2蛋白的分泌量仍能达到较高水平29.09±1.87 pg/ml。
　　3.包封精氨酸-壳聚糖/pBMP-2纳米粒的PELA微囊体外成骨诱导效能的研究
　　图3-3可见PELA/Arg-CS/pB MP-2纳米粒组的钙结节沉积明显多于其它处理组，同时ALP活性分析显示，在培养第7天，PELA/Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的ALP活性均高于其它处理组(P＜0.05)，PELA/CS/pBMP-2纳米粒组与PELA/pBMP-2组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，而PELA微球组与PELA/pBMP-2组的ALP活性差异无统计学意义(P＞0.05)。到第14天，PELA/Arg-CS/pBMP-2纳米粒组的ALP活性大于PELA/CS/pBMP-2组(P＜0.05)，PELA/pBMP-2组(P＜0.01)和PELA组(P＜0.01)，其差异有统计学意义。PELA/CS/pBMP-2组的ALP活性高于PELA/pBMP-2组，有显著统计学差异(P＜0.01)。
　　结论:
　　本研究将精氨酸修饰的壳聚糖作为BMP-2质粒基因的载体，进而提高BMP-2基因的入胞性能及促进细胞内BMP-2蛋白的高表达水平。同时制备的包封Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的PELA微球也实现对Arg-CS/pBMP-2纳米粒子的长效缓释，促进成骨前体细胞的成骨分化，这为其今后临床治疗骨缺损提供了重要依据。然而，活体内环境复杂多变，在体内多种因素影响下能否仍然保持其良好成骨诱导性能，尚需进一步研究以验证其有效性。

目录

摘要

第一部分 精氨酸-壳聚糖／pBMP-2纳米粒的制备、表征及细胞转染性能研究

引言

1 材料与方法

2 统计方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 包封精氨酸-壳聚糖／pBMP-2纳米粒的PELA微囊的制备、表征及其缓释能力研究

引言

1 材料与方法

2 统计方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三部分 精氨酸-壳聚糖／pBMP-2纳米粒控释微球在体外促进成骨作用的实验研究

引言

1 材料与方法

2 统计分析

3 结果

4 讨论

参考文献

文献综述

攻读硕士学位期间成果

致谢

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