羊种布鲁氏菌外膜蛋白诱导的细胞凋亡分子机制

摘要

布鲁氏菌（Brucella，简称布鲁菌）是一种胞内寄生的革兰氏阴性病原菌，能够引起一种世界范围内广泛流行的人畜共患传染病——布氏菌病(Brucellosis，简称布病)。世界动物卫生组织(OIE)将布病归为B类重要传染病，我国也将该疾病列为乙类传染病。
　　布鲁菌能在巨噬细胞(macrophages)、树突状细胞(DCs)和胚胎滋养层细胞液泡中寄生并大量繁殖，主要的入侵途径分为五个步骤:黏附、内生化、侵入、存活和复制。布鲁菌进入宿主细胞后，其独特的胞内生存方式，如将菌体和抗体隔离，使抗体无法发挥作用，用以逃避宿主先天性免疫和获得性免疫应答，进而驱动了布鲁菌独有的病理学状态:侵入并在宿主组织中传播最终长期存在于宿主体内造成慢性感染，引起严重的器官损伤，甚至可能导致宿主生物死亡。TLRs(Toll-like receptors)主要表达于免疫系统中的巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和淋巴细胞表面，可以通过识别表达在细菌、病毒和真菌组成物上广谱的病原体相关分子模式(PAMPs)，启动宿主抗感染的天然免疫应答的炎症反应。
　　TLR2和TLR4都参与了B.abortus感染诱导的炎症反应，热灭活的B.abortus(HKBA)通过TLR2诱导细胞表达TNF-α和IL-6。已有研究证明布鲁菌，LPS并不是炎症反应的调节因素，然而布鲁菌脂蛋白作为TLR2的配体，具有刺激内源性炎症因子表达的能力，但只有L-OMP16和L-OMP19能诱导TNF-α、 IL-6、IL-10和IL-12的分泌，并存在时间和剂量依赖性，而U-OMP16和U-OMP19并不具有这个能力。同时，布鲁菌脂蛋白L-OMP19能够诱导内皮细胞产生趋化因子、IL-6以及粘附分子等。HKBA和L-OMP19可以通过TNF受体1(TNFR)诱导小鼠星形胶质细胞凋亡和增殖，促进IL-6、IL-1β、TNF-α、 MCP-1和KC分泌。很多研究证明OMPs既是免疫保护抗原，同时又能与毒力基因相互作用，故而很多有关细菌致病机制和免疫反应机制的研究都集中在OMPs的研究上。巨噬细胞和胎盘滋养层细胞都是布鲁菌的主要宿主细胞，然而，对布鲁菌如何在吞噬细胞中进行持续性繁殖以及病原体-宿主的相互关系知之甚少。究竟布鲁菌哪些OMPs能与天然免疫TLR信号通路中介质信号蛋白发生互作，参与TLR信号通路的负调控机制，使布鲁菌长期在巨噬细胞或胚胎滋养层细胞内生存？另外，布鲁菌感染后可导致宿主细胞两种截然相反的命运:一是引起机体的免疫耐受、抗凋亡;二是引起细胞凋亡，导致孕畜流产。在这两种情况中，外膜蛋白扮演何种角色，如何发挥作用尚未可知，尤其脂蛋白OMP19和OMP16不同表现形式在布鲁菌感染细胞内的生物学功能和作用机制也未明确。
　　目的:
　　本文旨在研究布鲁菌外膜蛋白与诱导巨噬细胞和/或胚胎滋养层细胞凋亡的关系及其作用机制，发现与外膜蛋白相互作用的胞内信号通路蛋白，为进一步揭示布鲁菌侵染细胞的过程中发挥作用的可能毒力因子，通过了解布鲁菌的胞内生存途径的分子机制及特点，能够为布病的预防和控制提供借鉴。
　　方法:
　　(1)羊种布鲁菌脂蛋白的制备:利用PCR技术从布鲁菌疫苗株M5-90的基因组中调取布鲁菌脂蛋白U-OMP19、L-OMP16、U-OMP16、L-OMP10和U-OMP10的基因。插入原核表达载体pET-28a(+)中，构建重组质粒并进行表达，SDS-PAGE、WB鉴定表达情况。分别进行包涵体溶解、复性与镍柱纯化。
　　(2)羊种布鲁菌外膜蛋白诱导细胞凋亡实验:羊种布鲁菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L-OMP19、U-OMP19、L-OMP16、U-OMP16和U-OMP10，分别孵育Huh7.5.1人肝癌细胞、JEG-3人绒毛膜癌细胞、未活化的THP-1人急性单核细胞白血病细胞和经1，25(OH)2D3活化的THP-1细胞，收集孵育24小时、48小时和72小时后的细胞，利用流式细胞术检测体外刺激细胞凋亡情况。
　　(3)羊种布鲁菌外膜蛋白诱导细胞分泌细胞因子:羊种布鲁菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L-OMP19、U-OMP19、L-OMP16、U-OMP16和U-OMP10，分别孵育Huh7.5.1细胞、JEG-3细胞、未活化的THP-1细胞和经1，25(OH)2D3活化的THP-1细胞，收集孵育24小时、48小时和72小时后的细胞培养上清，通过ELISA方法检测细胞培养上清中CXCL、MCP-1、IL-6、IL-8、TNF-α以及IL-1β的表达情况。
　　(4)与THP-1细胞凋亡相关的蛋白筛选:收集羊种布鲁菌脂蛋白L-OMP19、U-OMP19、L-OMP16、U-OMP16和U-OMP10孵育活化的THP-1细胞72h后的沉淀，进行细胞裂解，并用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度后，送RayBiotech公司进行凋亡蛋白质芯片的检测分析。
　　结果:
　　(1)制备羊种布鲁菌脂蛋白:从M5-90疫苗株基因组中，扩增获得L-OMP10和U-OMP10的基因产物片段大小约为381bp及324bp，L-OMP16和U-OMP16的基因产物片段大小约为507bp及435bp，U-OMP19的基因产物片段大小约为510bp，基因测序结果正确。将测序正确的基因序列翻译为氨基酸序列后，分别分析L-OMP10与U-OMP10，L-OMP16与U-OMP16，L-OMP19与U-OMP19之间氨基酸序列差异，确定OMP10、OMP16、OMP19的序列存在细菌脂蛋白前体:氨基末端信号肽以一个四肽序列结束，符合前脂蛋白剪切与加工所需的共有序列。重组质粒经诱导表达后，除了L-OMP10其余蛋白均成功表达。U-OMP10蛋白分子大小约15kDa，L-OMP16和U-OMP16蛋白分子大小约18kDa和17kDa，U-OMP19蛋白分子大小约23kDa。包涵体洗涤溶解后进行复性，分泌蛋白用镍柱进行纯化。采用针对His标签的抗体检测蛋白表达，Western Blot显示蛋白大小与预期一致。
　　(2)羊种布鲁菌外膜蛋白诱导的细胞凋亡:流式细胞检测结果显示，羊种布鲁菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10，不能诱导Huh7.5.1人肝癌细胞和JEG-3人绒毛膜癌细胞的凋亡。除布鲁菌非脂化蛋白U-OMP16以外，其他布鲁菌外膜蛋白均不能诱导未活化的THP-1人急性单核细胞白血病细胞凋亡。U-OMP16诱导未活化的THP-1细胞凋亡具有时间依赖性，凋亡率随着刺激时间的增加升高，而且不受蛋白污染物的影响。
　　流式细胞检测羊种布鲁菌外膜蛋白诱导活化THP-1细胞凋亡的结果显示，只有U-OMP16、L-OMP16和U-OMP10在24h后开始表现出促凋亡的作用，且细胞凋亡率随着时间的推移而增加，尤其U-OMP16诱导THP-1细胞凋亡的作用最强;BP26和U-OMP19在48小时表现出诱导活化THP-1细胞凋亡的能力，但72h时BP26诱导的细胞凋亡率可达26％;而L-OMP19却在72小时后才开始表现出较弱的诱导活化THP-1细胞凋亡的能力;OMP31和OMP25则完全不具备诱导活化THP-1细胞凋亡的能力。
　　(3)羊种布鲁菌外膜蛋白诱导细胞分泌细胞因子的情况:U-OMP16能诱导未活化THP-1细胞分泌IL-6、TNF-α、CXCL、MCP-1、IL-1β和IL-8。其中IL-8和TNF-α表达水平随时间增加而降低，其余细胞因子IL-6、CXCL、MCP-1和IL-1β的表达升高，MCP-1和IL-1β在48小时后表达开始下降。THP-1细胞经1，25(OH)2D3活化后能低水平分泌MCP-1，而且在羊种布鲁菌外膜蛋白孵育细胞后能上调该因子的表达。BP26、L-OMP19和U-OMP19仅诱导活化THP-1细胞分泌低水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。L/U-OMP16和U-OMP10诱导活化THP-1分泌较高水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。而且，羊种布鲁菌外膜蛋白刺激活化THP-1细胞，细胞因子MCP-1、TNF-α、IL-1B和IL-6的表达水平，随着孵育时间的增加没有显著性的变化。
　　结论:
　　(1)制备了U-OMP10、L/U-OMP16和U-OMP19的原核表达重组蛋白。
　　(2)通过流式检测发现布鲁菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10不具备诱导Huh7.5.1细胞和JEG-3细胞凋亡的能力。
　　(3)除OMP31和OMP25外，其余6种外膜蛋白(BP26、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10)均能诱导活化THP-1细胞凋亡，并促进炎症因子的表达，其中U-OMP16的作用最强。因此，OMP16可能是参与布鲁菌感染诱导细胞凋亡的关键毒力因子，而OMP31和OMP25并非参与细胞凋亡的关键毒力因子。
　　(4)OMP19可能在细胞凋亡过程中具有双重调节作用，尤其U-OMP19是否依赖于SMAC对XIAP的抑制作用，最终导致细胞凋亡仍需进一步研究。
　　(5)根据蛋白芯片结果，布鲁菌脂蛋白可能通过线粒体途径参与了细胞凋亡的过程，但与之相互作用的凋亡相关蛋白及其作用机制还需进一步验证，包括诱导后THP-1细胞内HSP60的表达显著性增高的意义。

目录

摘要

前言

1．1 布鲁氏菌胞内感染机制

1．2 布鲁氏菌病发病机理

1．3 布鲁氏菌外膜蛋白的研究现状

1．4 立题意义

2．材料

2．1 菌株、质粒和细胞

2．2 主要试剂

2．3 主要溶液

2．4 主要仪器

3．方法

3．1 羊种布鲁菌脂蛋白OMP19、OMP16、OMP10分子克隆

3．2 羊种布鲁氏菌外膜蛋白诱导细胞凋亡功能验证

3．3 统计学分析

4．结果

4．1 脂蛋白的基因扩增

4．3 外膜蛋白与Huh7．5．1细胞凋亡的关系

4．4 外膜蛋白与JEG-3细胞凋亡的关系

4．5 外膜蛋白与未活化的THP-1细胞凋亡的关系

4．6 外膜蛋白与活化的THP-1细胞凋亡的关系

5．讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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