CCND1在结肠癌中受microRNA-340调控而增加细胞对5-Fu的耐药

摘要

结肠癌(colorectal cancer，CRC)是发生在结肠部位的消化道肿瘤，发病率有逐渐升高的趋向。
　　目的：
　　分析CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中的表达特性;
　　研究干扰CCND1后结肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化;
　　研究miR340调控结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响;
　　验证CCND1为miR340的直接靶向基因。
　　方法：
　　1.CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中表达特性
　　1)用实时荧光定量RT-qPCR技术检测CCND1在结肠癌组织及正常肠组织中mRNA水平表达差异;
　　2)采用western-blotting技术检测CCND1在结肠癌组织及癌旁组织中的蛋白水平表达差异;
　　3) IHC观察CCND1蛋白在结肠癌癌症组织和其对应的癌旁组织的表达情况。
　　2.研究经干扰CCND1作用后，结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的变化
　　1)采用siRNA干扰技术，将3个携带干扰CCND1序列的siRNA和对应negtivecontrol的siRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中，通过RT-qPCR和western-blotting在RNA水平和蛋白水平验证干扰效率，筛选出干扰效率最高的片段，进行后续实验;
　　2)铺96孔板，将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中，加入5-Fu后检测IC50值，观察药物浓度反应效果。
　　3.研究miR340对结肠癌细胞对5-Fu的敏感性的影响
　　1)利用瞬时转染技术，将miR340的mimic分别转入HCT116和SW480细胞中，RT-qPCR检测瞬转效率;
　　2)铺96孔板，将过表达miR340 mimic的SW480细胞和negtive control细胞分别接种到孔板中，加入5-Fu后检测IC50值，观察药物浓度反应效果。
　　4.验证CCND1为miR340的直接靶向基因
　　1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic，48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平;
　　2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor，48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平
　　3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因，miR-340可结合到CCND1的3'UTR端;
　　4)用双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。
　　5.统计学分析:采用SPSS21.0统计软件对结果得到的数据采取统计检测P值，计量资料的数值用(x)±s来显示。①实时荧光定量PCR检测各种癌和癌旁组织或结肠癌细胞表达量的2-△△C t值的统计使用单因素方差分析方法(ONEWAYANOVA)，如有统计学意义，进行多重比较，采用Dunnett方法;②生存分析用单因素Cox回归模型，再用多因素Cox回归模型确定各参数是否可作为独立预后因素;两组间率的比较采用四格表卡方检验）;③噻唑蓝方法观察药物浓度反应曲线，应该拿析因设计资料的方差分析进行数据处理，结果如果有统计学差异，不同组别之间同一个药物浓度的OD值比较采用unpaired t test，同一个组不同药物浓度测出来的OD值采用One-Way ANOVA方法分析，如果存在统计学上的差异，不同的药物浓度之间的两两比较使用Duunett统计学方法;④不同处理组间的比值、穿膜细胞数等指标采用两独立样本t检验;以P＜0.05认定为其结果具有统计学差异。
　　结果:
　　1.与正常肠组织相比，CCND1的表达量在癌组织中显著偏高，且卡方检验得出表达量与T分期相关（即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者），与年龄、性别、N分期、临床分期无关。单因素和多因素Cox回归分析得出年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。
　　1)通过RT-qPCR检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1mRNA含量，发现癌组织的mRNA水平明显高于癌旁组织mRNA水平(P＜0.01)，数据统计应用两独立样本t检验，结果有统计学意义;
　　2)通过western-blotting检测癌组织及对应癌旁组织中CCND1蛋白含量，以GADPH为内参，发现癌组织的CCND1蛋白含量明显高于癌旁组织;
　　3)IHC结果显示，CCND1主要在核表达。与癌旁组织相比，CCND1在癌组织中染色更深，表达细胞比例更多，统计学分析其在两种组织中的表达有显著性差异(P＜0.01)。CCND1表达量与临床参数之间相关性的统计学分析证明，CCND1的表达量与T分期显著相关(P＜0.01)，即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者，而与性别、年龄、N分期、临床分期无关(P值分别为0.484,0.774,0.135,0.503);
　　4)经单因素生存分析，年龄、CCND1表达量和N分期都可影响患者的总体生存时间，年龄＞65岁患者预后差于年龄＜65岁患者(P＜0.01)，CCND1高表达的患者预后差于低表达者(P＜0.01)，N0患者预后明显好于N1-N2患者(P＜0.01)。多因素生存分析结果表示，年龄(P＜0.01)、CCND1表达量(P＜0.05)以及N分期(P＜0.01)可以作为患者预后的独立影响因素，而性别、T分期和临床分期(P值分别为0.723，0.262，0.132)均不构成独立影响因素。
　　2.干扰CCND1后，结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加
　　1)采用SiRNA干扰技术，将携带干扰CCND1序列的3个siRNA和对应negtivecontrolsiRNA分别转到2个结肠癌细胞株HCT116和SW480中，分别于转染后的24小时、48小时通过RT-qPCR和western-blotting来验证CCND1在RNA和蛋白水平的干扰效率，筛选出干扰效率最高的2号片段，48小时的干扰效率分别达79％和68％，故在后续的试验中，选定2号片段，干扰48小时作为实验标准;
　　2)铺96孔板，将干扰CCND1的HCT116和SW480细胞和相应的negtive control细胞分别接种到孔板中，加入5-Fu作用48小时后检测2组细胞的IC50值，观察药物浓度反应效果。结果显示，干扰CCND1后，HCT116和SW480的IC50值均有下降，HCT116细胞的siCCND1组IC50值约为10uM，negtive control组的IC50值为20uM， SW480细胞的siCCND1组IC50值也约为10uM，negtivecontrol组的IC50值约为20uM。经siCCND1干扰后，两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.过表达miR-340后，结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加
　　1)利用瞬时转染技术，将miR-340的mimic转入结肠癌细胞株HCT116和SW480细胞中，RT-qPCR检测瞬转效率分别高于对应negtive control3倍和4倍(P＜0.01);
　　2)铺96孔板，将过表达miR340 mimic的HCT116和SW480细胞及对应的negtive control细胞分别接种到孔板中，加入5-Fu后48小时检测IC50值，观察药物浓度反应效果。结果显示，过表达miR-340后，HCT116和SW480的IC50值均有下降，HCT116中siCCND1组IC50值约为10uM，对照为20uM， SW480中siCCND1组IC50值也约为10uM，对照约为20uM。两株细胞对5-Fu的敏感性均有增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.验证CCND1为miR-340的直接靶向基因
　　1)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的mimic，48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平，结果显示两株细胞中CCND1表达水平均明显下降(P＜0.01);
　　2)在两株结肠癌细胞HCT116和SW480中转染miR-340的inhibitor，48小时后RT-qPCR和western-blotting检测CCND1的mRNA水平及蛋白水平均有上升(P＜0.05);
　　3)用生物预测软件预测到CCND1可能为miR-340的靶基因，mi-340可结合到 CCND1的3'UTR端;
　　4)双荧光素酶报告显示miR-340可直接靶向CCND1。
　　结论:
　　CCND1在结肠癌中高表达，其表达量与T分期相关（即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表达明显高于Ⅰ-Ⅱ期的患者），且年龄、N分期与CCND1的表达量可作为独立预后因素。干扰CCND1后，发现结肠癌细胞对5-Fu的敏感性增加，同样，过表达miR-340后细胞对5-Fu的敏感性也显著增加。通过生物软件预测及双荧光素酶报告证实，miR-340可以直接靶向CCND1。换句话说，CCND1可以受miR-340的抑制从而影响结肠癌细胞对5-Fu的敏感性。

目录

摘要

前言

第一章 CCND1在结肠癌组织中的表达情况鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 小结和讨论

第二章 干扰CCND1可增加结肠癌细胞对5-Fu的敏感性

1 材料、方法

2 结果

3 小结和讨论

第三章 miR-340对结肠癌细胞株5-Fu耐药的影响

1 资料与方法

2 结果

3 小结和讨论

第四章 miR340可直接靶向CCND1

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

文献综述

缩写词简表

成果

致谢

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