次氯酸修饰白蛋白诱导糖尿病大鼠足细胞凋亡的机制及线粒体靶向肽的保护作用

摘要

目的：本课题采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠作为模型，验证我们的假设:糖尿病环境中，HOCl-alb通过诱导线粒体功能失常和细胞内活性氧产生，激活凋亡信号，诱导足细胞凋亡，导致肾小球基底膜屏障功能受损，最终导致蛋白尿发生和肾小球硬化。线粒体靶向抗氧化剂SS-31可能通过阻断线粒体氧化应激损伤，抑制HOCl-alb对足细胞的促凋亡通路，减少足细胞的丢失和蛋白尿的形成，从而起到预防或延缓糖尿病肾病进展的作用。
　　方法：一.体外制备无内毒素HOCl修饰的大鼠血清白蛋白(HOCl-RSA)及其鉴定:
　　采用Witko-Sarsat等介绍的方法。将无内毒素的RSA溶液与次氯酸溶液按照1∶140摩尔比混合，室温放置30分钟。制备的HOCl-RSA在4℃无内毒素磷酸盐(PBS)缓冲液中透析24小时，以除去游离的次氯酸。用0.22μm一次性针头滤器过滤除菌，分装后4℃保存。将无内毒素的RSA溶液与无菌PBS等体积混合，作为对照。试验中所有玻璃器皿均放入180℃烤箱4小时以去除内毒素。
　　采用鲎试验法测定制备的HOCl-RSA内毒素含量，并证实内毒素水平低于0.025EU/ml。
　　二.SS肽的合成和进入线粒体的鉴定
　　1.SS肽的合成
　　SS肽由杭州中肽公司协助合成，SS肽氨基酸序列和化学结构如下:SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2, Dmt=2',6'-dimethyltyrosine), SS-31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2)。
　　2.线粒体提取
　　取肾组织（皮质），按照试剂盒说明书提取线粒体。
　　3.SS肽体外进入线粒体的鉴定
　　结果显示，SS-02分布于线粒体外膜约20-30％，线粒体内膜约50％，线粒体基质20-30％。
　　三.糖尿病模型的制备和分组
　　1、模型制备
　　成年雄性SD(SpragueDawley)大鼠，购于南方医科大学实验动物中心，体重180-220g，在恒温SPF级环境饲养，自由进食及饮水。禁食16小时后单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mg/kg（溶于0.01mol/L柠檬酸缓冲液，PH4.5，现配现用），72小时后剪尾取血，用电子血糖仪测量血糖，血糖值＞16.7mmol/L作为糖尿病(DM)动物模型。
　　2、实验动物分组
　　3、标本留取
　　于分组后进行大鼠干预16周，取标本前一天将大鼠放于代谢笼中留取24小时尿并记录尿量，离心20分钟(4℃3000rpm)，分装后-70℃冰箱冻存。
　　四.检测指标
　　1.生化指标。
　　2.肾皮质匀浆、血浆HOCl-alb浓度检测:采用分光光度法。
　　3.尿8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)定量:应用商品化的ELISA试剂盒检测。
　　4.病理组织学观察:肾皮质经固定、脱水、石蜡包埋，4μm切片，行PAS及Masson染色。
　　5.足细胞凋亡的变化:冰冻切片TUNEL荧光标记法计数凋亡的足细胞
　　6.Western Blotting检测相关蛋白:肾皮质匀浆，提取总蛋白，检测caspase-3，caspase-7，caspase-9，WT-1和PARP-1表达;肾皮质匀浆，分别提取线粒体蛋白和胞浆蛋白，检测Cytochrome C表达。
　　7.免疫组织化学计数肾小球足细胞数目。
　　结果：一、大鼠物理和生化指标变化:
　　1、体重
　　糖尿病组大鼠体重均较正常组对照组①、②下降(①623.72±21.20，②619.23±23.47 vs③249.62±29.11，④173.35±27.60，⑤310.14±32.75，⑥241.38±27.29，P均＜0.001），注射HOCl-alb及干预性SS-31治疗均对体重无显著影响（P＞0.05 vs组③）。
　　2、血糖
　　糖尿病组大鼠血糖均高于正常组对照组①、②（①5.6±0.8，②5.8±1.0 vs③29.78±2.51，④31.46±3.23，⑤32.34±2.76，⑥30.40±2.48，P均＜0.001），证明糖尿病大鼠成模，而注射HOCl-alb及干预性SS-31治疗均对血糖无显著影响（P＞0.05 vs组③）。
　　3、尿白蛋白排泄量
　　糖尿病组大鼠24小时尿蛋白定量高于正常对照组①、②（①0.19±0.05，②0.21±0.03，③0.34±0.09，④0.51±0.10，⑤0.27±0.08，⑥0.30±0.11,P＜0.05 vs组①、②），同时注射HOCl-alb使糖尿病大鼠尿蛋白排泄量增加（③0.34±0.09 vs④0.51±0.10，P＜0.01），SS-31干预治疗则可显著减轻HOCl-RSA引起的尿蛋白排泄量增加（④0.51±0.10 vs⑤0.27±0.08，⑥0.30±0.11，P＜0.01）。
　　4、肌酐清除率:
　　糖尿病组大鼠肌酐清除率均高于正常组对照组①、②（①6.24±1.09，②6.37±1.22vs③10.61±2.36，④13.95±4.62，⑤7.67±1.84，⑥8.80±2.03，P均＜0.05），注射HOCl-alb使糖尿病大鼠肌酐清除率升高(③10.61±2.36 vs④13.95±4.62，P＜0.05)，SS-31干预治疗则可改善HOCl-alb引起的肌酐清除率升高(④13.95±4.62 vs⑤7.67±1.84,⑥8.80±2.03, P＜0.01)。
　　二、肾组织病理学改变
　　肾组织经Masson染色和PAS染色，光镜下观察显示，正常对照组大鼠肾小球结构完整，大小均一，基底膜、系膜无增生，肾小管管壁光滑无变性。糖尿病组大鼠肾小球体积增大，肾小球基底膜增厚和系膜轻度增生，肾小管上皮细胞呈灶性脱落坏死、颗粒样和空泡样变性。注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠比注射RSA组糖尿病大鼠病理改变更明显，部分肾小球已阶段性硬化，而注射SS-31组糖尿病大鼠的大部分病理改变则被阻断。
　　三、氧化应激指标变化:
　　1、血浆HOCl-alb含量
　　2、肾组织匀浆HOCl-alb含量
　　3、尿8-OHdG定量
　　四、Cyt C蛋白表达的变化:
　　应用Western Blotting检测了细胞色素C的表达。结果显示，与正常对照大鼠相比，糖尿病大鼠胞浆内CytC蛋白水平明显增加（P＜0.015 vs组①、②）;与注射RSA组糖尿病大鼠相比，注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠胞浆内CytC水平进一步增加（P＜0.008 vs组③）;SS-31干预则可改善HOCl-RSA引起的胞浆内CytC水平增加（P＜0.021 vs组④）各组线粒体内CytC蛋白水平的变化与胞浆内CytC蛋白水平的变化相反。
　　五、足细胞凋亡的变化
　　采用TUNEL荧光标记法检测凋亡的足细胞。与正常对照组相比，糖尿病大鼠TUNEL阳性细胞数目明显减少（P＜0.028 vs组①、②）;注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠TUNEL阳性的足细胞比注射RSA组糖尿病大鼠显著增高(p=0.012);线粒体靶向肽SS-31干预显著降低了HOCl-RSA诱导的足细胞凋亡(p=0.023)。提示了SS-31能降低足细胞氧化应激，进而减少了足细胞凋亡。
　　六、凋亡相关蛋白表达:
　　在氧化应激诱导凋亡的信号通路中，caspase-3是caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者。
　　七、足细胞丢失数量的变化:
　　为了验证HOCl-alb诱导足细胞凋亡导致肾小球足细胞丢失，足细胞数目减少，应用足细胞细胞核特异性抗原WT-1染色肾小球足细胞来计数肾小球足细胞数目。每个肾小球记录WT-1阳性核染色数目。每组选取8只大鼠，随机选择50个肾小球计算WT-1阳性核数目，取平均值。结果显示，与正常对照组相比，糖尿病大鼠WT-1阳性细胞数目明显减少（P＜0.030 vs组①、②）;与注射RSA组糖尿病大鼠相比，注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠WT-1阳性细胞数目进一步降低（P＜0.011 vs组③）; SS-31干预显著改善了HOCl-RSA诱导的足细胞丢失（P＜0.009 vs组④）。
　　采用Western Blotting检测WT-1蛋白的表达。结果显示，与正常对照组相比，糖尿病大鼠WT-1蛋白水平明显减少（P＜0.018 vs组①、②）;注射HOCl-RSA组糖尿病大鼠比注射RSA组糖尿病大鼠WT-1蛋白水平进一步降低(P＜0.003 vs组③);SS-31干预显著改善了HOCl-RSA诱导的WT-1蛋白水平降低(P＜0.007vs组④)。
　　结论：一、HOCl-alb加重糖尿病大鼠蛋白尿、肾小球高滤过和肾损伤，其机制可能是通过诱导体内氧化应激和线粒体损伤，细胞色素C外流，胞浆中细胞色素C水平上调激活凋亡相关信号，进而导致足细胞凋亡、足细胞丢失和数量减少。
　　二、线粒体靶向肽的干预阻止了HOCl-alb诱导的足细胞凋亡，从而起到肾保护作用。因此，阻断线粒体氧化应激损伤，可能成为能够延缓糖尿病肾病进展、改善糖尿病肾病预后的新靶标。

目录

摘要

前言

材料与方法

一、实验材料

二、体外制备无内毒素HOCl修饰的大鼠白蛋白(HOCl-RSA)

三、SS肽的合成和进入线粒体的鉴定

四、动物模型制备及分组

五、标本的收集和处理

六、检测步骤

七、统计学方法

结果

一、无内毒素HOCl-alb修饰蛋白的鉴定

二、大鼠物理和生化指标变化

三、肾组织病理学改变

四、氧化应激指标变化

五、Cyt C蛋白表达的变化

六、足细胞凋亡的变化

七、凋亡相关蛋白表达

八、足细胞丢失数量的变化

讨论

结论

参考文献

综述

缩略语词汇表

攻读学位期间成果

致谢

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