次氯酸修饰白蛋白对肾脏纤维化大鼠线粒体功能的影响及抗氧化肽Ss-31的保护作用

摘要

研究目的：
　　肾脏纤维化是几乎所有慢性肾脏病(CKD)的最终归宿，影响肾脏纤维化的原因有很多，其中氧化应激在肾脏纤维化的发生发展过程中起到了关键作用。氧化应激即活性氧簇(ROS)的产生和清除失衡，线粒体作为ROS产生的主要部位，更容易受到ROS的攻击而出现损伤，引起线粒体功能障碍，进而导致一系列疾病。目前已有许多研究证明线粒体功能障碍与多种肾脏疾病如糖尿病肾病、梗阻性肾病、缺血-再灌注肾损伤模型密切相关，但是线粒体功能障碍加重慢性肾脏纤维化的内在机制还不是十分清楚，在此次研究中，我们探讨次氯酸修饰白蛋白(HOCl-alb)在慢性肾衰竭大鼠模型中介导氧化应激和纤维化反应方面的作用和机制。
　　研究方法:
　　32只雄性SD大鼠行5/6肾脏切除术后随机分为四组，每组8只，分别处理如下:(1)磷酸盐缓冲液(PBS)，尾静脉注射与HOCl-RSA等体积量;(2)次氯酸修饰白蛋白(HOCl-RSA)20mg/kg，尾静脉注射，隔日一次;(3)抗氧化肽SS-313mg/kg，腹腔注射，每日一次;(4)同时注射HOCl-RSA及SS-31，隔日一次;另设假手术组(n=8)为对照组。于第13周将各组大鼠放置入代谢笼留取24小时尿量后处死动物，留取血液及肾组织进行后续检测。检测各组大鼠血肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)，尿肌酐(Ucr)量，24小时尿蛋白定量(Up)，计算肌酐清除率(Ccr);光镜下观察肾小球及肾间质纤维化程度并计算评分比较;新鲜肾组织提取线粒体后检测线粒体膜电位(MMP)，以及肾皮质匀浆中ATP含量及线粒体活性氧（mtROS）含量;检测各组大鼠血浆及肾组织匀浆中HOCl-alb含量，锰SOD(MnSOD)活性等氧化应激相关指标;免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏巨噬细胞(ED-1阳性细胞)浸润数量、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)水平的表达并计算各组评分后比较。蛋白质印迹法(Western Blot)法检测各组大鼠肾脏线粒体及胞浆蛋白细胞色素C(Cyto C)水平，以及TGF-β1、COL-Ⅰ、MCP-1、α-SMA水平的表达。经肾皮质提取RNA后反转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测各组大鼠线粒体DNA(mtDNA)复制数量、TGF-β1、COL-Ⅰ、MCP-1、α-SMA水平的表达。
　　研究结果:
　　与对照组相比，5/6肾脏切除大鼠出现线粒体功能障碍，具体表现为MMP下降，ATP生成减少，mtDNA复制数量减少，Cyto C从线粒体的释放增加，MnSOD活性下降，以及大量产生的mtROS。血浆以及肾组织中HOCl-alb水平显著升高，同时伴随着细胞外基质的明显沉积，大量出现的蛋白尿，恶化的肾功能;炎症指标方面巨噬细胞浸润数量增加，MCP-1表达增多，纤维化指标如TGF-β1、COL-Ⅰ、α-SMA表达水平也明显升高。注射HOCl-RSA后显著加重了上述指标的变化，而注射线粒体靶向抗氧化肽SS-31后大鼠肾脏各项病理指标均明显改善。
　　研究结论:
　　HOCl-alb水平的升高可能导致肾脏的炎症及纤维化，并且可能与线粒体氧化应激和功能障碍密切相关。此外，线粒体靶向抗氧化肽SS-31可能为治疗肾脏纤维化和慢性肾衰竭(CRF)提供了新的思路和方法。

目录

摘要

前言

一、实验材料

二、体外无内毒素次氯酸修饰白蛋白(HOCl-RSA)制备及鉴定

三、SS肽的合成和进入线粒体的鉴定

四、大鼠5／6肾脏切除模型的建立与分组处理

五、大鼠肾组织标本留取与处理

六、大鼠肾功能检测

七、大鼠肾脏组织病理学检测及评分

八、大鼠肾脏线粒体提取及功能检测

九、大鼠氧化应激相关指标检测

十、石蜡切片免疫组织化学染色及评分

十一、蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测

十二、实时荧光定量Real-time PCR检测

十三、统计方法

结果

二、注射HOCl-RSA对5／6肾切除大鼠肾组织损伤的影响

三、注射HOCl-RSA对5／6肾切除大鼠肾脏线粒体功能的影响

四、注射HOCl-RSA对5／6肾切除大鼠肾脏氧化应激的影响

五、注射HOCl-RSA对5／6肾切除大鼠肾脏炎症的影响

六、注射HOCl-RSA对5／6肾切除大鼠肾脏纤维化的影响

讨论

参考文献

英文缩写词简表

硕士攻读期间取得成果

致谢

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