内质网应激参与晚期氧化蛋白产物诱导足细胞凋亡的机制研究

摘要

糖尿病肾病（DN）是全球范围内引起终末期肾病(ESRD)的主要原因之一。蛋白尿是DN的首要临床特征，也是判断DN严重程度的指标，同时蛋白尿又是DN进展的独立危险因素之一。我们推测ERS参与AOPPs诱导的足细胞凋亡可能是由AOPPs与RAGE结合后通过NADPH氧化酶依赖的ROS生成所介导的。
　　目的：
　　旨在通过体外培养小鼠足细胞证实我们上述假设，并进一步阐明AOPPs诱导足细胞凋亡的具体机制。
　　方法：
　　1.AOPPs修饰的小鼠白蛋白(AOPPs-MSA)的制备和鉴定
　　AOPPs-MSA的制备和鉴定参考文献报导所介绍的方法。将MSA溶液与浓度为200mmol/L的次氯酸以1/140的摩尔比例混合，室温反应30分钟(25～30℃);然后将制备的样品在4℃无菌PBS中透析24h，以去除残留的游离次氯酸。未经修饰的MSA与PBS等体积混合，作为对照。制备的所有AOPPs-MSA经Detoxi-Gel凝胶柱去除所含的内毒素，内毒素水平通过鲎试验法内毒素检测试剂盒检测，所制备的溶液中内毒素水平低于0.025EU/ml。AOPPs含量测定:在碘化钾存在的条件下，以不同浓度氯胺T制备标准曲线，测定酸性条件下340nm处的吸光度值。AOPPs-MSA和未经修饰的MSA中AOPPs的浓度分别为:70.2±3.41nmol/mg、0.23±0.05nmol/mg。在所有制备的样品中均不能检测到AGEs的成份。
　　2.足细胞的培养
　　小鼠足细胞按文献报导所介绍的方法培养。将未分化的足细胞系培养于含10％胎牛血清、链霉素(100μg/ml)、青霉素(100U/ml)、丙酮酸钠(1mmol/L)、碳酸氢钠(0.075％)和HEPES缓冲液(10mmol/L)的RPMI1640培养液中。在上述培养基中加入10u/ml的重组小鼠□-干扰素的条件下，置于33℃、5％CO2培养箱中，使足细胞处于“允许生长”的条件下生长传代。待细胞生长至70％-80％融合时，不加□-干扰素，置于37℃、5％CO2孵育箱内＞12天，使足细胞处于“限制生长”的条件下诱导分化，用于实验。本研究使用的是限制生长的10-18代条件性永生小鼠足细胞。
　　在部分实验中足细胞用ERS诱导剂thapsigargin(0.25μM)处理24h。在阻断实验中，在用200μg/mLAOPPs孵育足细胞24h之前分别用ERS抑制剂salubrinal(50μM)、ROS清除剂c-SOD(100U/mL)和NADPH氧化酶抑制剂DPI(10μ M)预处理1h。
　　3.实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达水平
　　收集细胞，加入TRIzol试剂，按试剂盒说明进行操作提取总RNA。按照PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒说明书操作将总RNA逆转到cDNA上。实时定量PCR是按照PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书完成。RT-PCR条件如下:95℃2分钟，然后95℃30秒与60℃35秒重复循环40次。
　　4.蛋白质印迹分析(Western blot analysis)检测蛋白表达水平
　　将细胞置于RIPA缓冲液中裂解，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，然后转移到PVDF膜上，再把PVDF膜浸泡在含5％脱脂奶粉的TBST中，室温下封闭2h;用兔抗小鼠PERK、IRE1、ATF6、p-PERK、p-IRE1、cleaved ATF6、CHOP、Bcl-2、caspase-12、cleaved caspase-3和RAGE抗体（1∶1000稀释）与PVDF膜在4℃孵育过夜。再用山羊抗兔二抗与上述PVDF膜在室温下孵育1h，用增强化学发光系统(ECL)检测蛋白，用Total Lab2.0定量条带密度，以β-actin为内参。
　　5.siRNA转染
　　非特异性siRNA和RAGE、PERK、IRE1和ATF6的siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司。按照试剂盒说明操作，用Lipofectamine2000将siRNA转染到足细胞。每段基因的靶向序列分别为:RAGE5'-GGUCAGAGCUGACAGUGAUTT-3',PERK5'-GCAGGTCCTTGGTAATCAT-3'，ATF65'-GCAAAGCAGCAGTCGATTA-3'，IRE15'-CCAATGTATGTCACAGAAA-3'.非特异性siRNA为阴性对照，Western blot检测siRNA转染后的干扰效果。
　　6.TUNEL检测细胞凋亡
　　按DeadEndTMTUNEL系统说明检测足细胞凋亡率。将细胞置于4％的多聚甲醛中在4℃温度下固定30分钟，再用0.1％ Triton X-100及0.1％柠檬酸钠透化细胞，然后加入TdT酶及荧光素结合核苷酸在37℃孵育60分钟。用荧光显微镜检测标记绿色荧光的凋亡细胞。用DAPI共染样本确定细胞核以鉴别假阳性凋亡细胞。
　　结果：
　　1.AOPPs诱导足细胞发生ERS
　　应用RT-PCR和Western blot分别检测了各组足细胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表达水平，我们发现AOPPs呈现时间和剂量依赖性上调了足细胞GRP78、CHOP的mRNA及蛋白表达水平;而空白对照组和未修饰MSA组均无明显上调，而且这两组比较也无显著差异，这说明GRP78、CHOP的过度表达与MSA的晚期氧化相关的。
　　2.AOPPs通过激活ERS诱导足细胞的凋亡
　　我们应用TUNEL的方法检测足细胞凋亡率。AOPPs刺激后足细胞的凋亡率较空白对照组和未修饰MSA组显著增加，而且ERS抑制剂salubrinal可部分阻断AOPPs的效应，而ERS激活剂thapsigargin则与AOPPs一样显著增加了足细胞凋亡率。
　　3.NADPH氧化酶介导了AOPPs诱导的ROS生成
　　AOPPs刺激后足细胞内ROS水平显著高于空白对照组及未修饰MSA组，而且NADPH氧化酶抑制剂(DPI)和ROS清除剂(c-SOD)显著抑制了AOPPs诱导的足细胞内ROS的生成。
　　4.NADPH氧化酶依赖的ROS生成介导了AOPPs诱导足细胞发生ERS
　　应用Western blot检测发现NADPH氧化酶抑制剂(DPI)和ROS清除剂(c-SOD)显著抑制了AOPPs诱导的足细胞GRP78和CHOP的蛋白水平表达。
　　5.ERS参与了AOPPs诱导的足细胞ROS生成
　　AOPPs刺激后足细胞内ROS水平显著高于空白对照组及未修饰MSA组，ERS抑制剂salubrinal部分阻断了AOPPs诱导的足细胞内ROS的生成;而ERS激活剂thapsigargin则与AOPPs一样显著增加了足细胞内ROS的生成。
　　6.NADPH氧化酶依赖的ROS生成介导了AOPPs诱导的足细胞凋亡
　　应用TUNEL方法检测了DPI或c-SOD存在的情况下AOPPs诱导的足细胞凋亡率，我们发现AOPPs刺激足细胞时加入DPI或c-SOD后细胞凋亡率均显著低于单用AOPPs刺激足细胞组。
　　7.RAGE特异性siRNA的有效性检测
　　分别用针对RAGE的靶向siRNA或错义序列无功能的scramble siRNA转染足细胞，用Western blot方法检测两组足细胞的RAGE蛋白表达以评估siRNA转染有效性，结果发现RAGE的siRNA组较scramble siRNA组RAGE蛋白水平显著降低，RAGE siRNA降低RAGE蛋白表达＞70％。
　　8.RAGE介导了AOPPs诱导足细胞ROS生成和ERS的发生
　　AOPPs刺激前分别用scramble siRNA（siNC组）或RAGE siRNA（siRNA组）转染足细胞，仅用scramblesiRNA转染细胞后无AOPPs刺激作为阴性对照;检测各组细胞内ROS水平发现siRNA组显著低于siNC组。应用Western blot检测结果表明RAGE siRNA转染后显著阻断了AOPPs诱导的足细胞GRP78和CHOP的蛋白表达。
　　9.RAGE介导了AOPPs诱导足细胞ROS生成和ERS的发生
　　AOPPs刺激前分别用scramble siRNA（siNC组）或RAGE siRNA（siRNA组）转染足细胞，再应用TUNEL的方法检测足细胞的凋亡率发现，RAGE siRNA转染组足细胞的凋亡率显著低于scramble siRNA转染组。
　　结论：
　　我们的研究结果证实了AOPPs可诱导足细胞ERS发生，并且AOPPs通过激活ERS诱导足细胞凋亡。其次，本研究也表明ERS参与AOPPs诱导的足细胞凋亡是由AOPPs与足细胞表面的RAGE结合后通过NADPH氧化酶依赖的ROS生成所介导的。再次，三条经典的UPR信号转导通路:PERK，ATF6和IRE1通路，均介导了ERS诱导的足细胞凋亡。最后，我们的研究证实两ERS相关的凋亡途径:CHOP-和caspase-12依赖途径，均介导了ERS诱导的足细胞凋亡，而且Bcl-2的抑制参与了CHOP凋亡途径。足细胞凋亡在糖尿病肾病的发病机理方面发挥关键性作用，而且AOPPs的聚集在糖尿病肾病患者中普遍存在，因此，我们的研究从ERS角度为糖尿病肾病的治疗提供了新的策略。

目录

摘要

前言

第一章 内质网应激参与AOPPs诱导的足细胞凋亡

材料与方法

结果

讨论

第二章 NADPH氧化酶依赖的ROS生成介导内质网应激参与AOPPs诱导足细胞凋亡

材料与方法

结果

讨论

第三章 内质网应激参与AOPPs诱导足细胞凋亡的信号转导通路

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 内质网应激与足细胞凋亡

缩写词简表

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