姜黄素经由活化ROS-ASK1-JNK通路增效ABT-737诱导肝癌细胞凋亡作用机制研究

摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)为当今世界范围内严重危害人类生命健康安全的常见恶性肿瘤之一，为全球第5位常见肿瘤，占癌症相关死亡的第三位。目前，肝癌治疗仍以手术为主，但20-35％的肝癌患者适合手术治疗，且术后复发率高，达50％。而肝动脉化疗栓塞(TACE)、局部消融治疗是非手术切除原发性肝癌的首先治疗，但因治疗的不沏底性，其疗效也不尽如人意。索拉非尼靶向治疗、FOLFOX4方案化疗是目前中晚期肝癌全身治疗一线选择，但延长生存期有限。因此，寻找有效治疗肝癌的新途径是目前肿瘤医学界所面临的巨大困难和挑战。Bcl-2、Bcl-xL以及Bcl-w是哺乳动物细胞内Bcl-2抗凋亡蛋白家族中的重要成员。他们共同包含BH1、BH2、BH3和BH4等4个BH结构域。据报道，Bcl-2抗凋亡蛋白能抑制线粒体外膜渗透性，从而抑制应激诱导下细胞凋亡。多种肿瘤组织中常出现Bcl-2抗凋亡蛋白异常表达，同时，常伴随着相关的治疗耐药。先前研究发现，Bcl-2抗凋亡蛋白的表达水平与与肝癌的临床病理分级以及患者预后呈负相关。因此，抗Bcl-2抗凋亡蛋白靶向药物治疗有望成为治疗肝癌的重要手段之一。ABT-737是由美国Abbot实验室所研发的一种小分子Bcl-2、Bcl-xL以及Bcl-w抑制剂，目前，ABT-737正进行白血病患者的Ⅰ期临床研究。前期也有报道，ABT-737能抑制多种肝癌细胞生长。然而，ABT-737在治疗肝癌细胞时常会同时激活其他抗凋亡信号通路，从而减弱ABT-737抗肿瘤效应。因此，需寻找新的治疗策略来改善ABT-737抗肿瘤效应。姜黄素(curcumin)是从中药姜黄中提取得到的天然色素成分。目前大量研究证实，姜黄素对多种恶性肿瘤具有抗瘤效应，包括肝癌。多个前期研究表明，姜黄素能有效抑制体内外肝癌细胞的生长。而且，姜黄素能明显增强常规化疗和靶向药物的抗瘤效应。但是，姜黄素和ABT-737之间是否存在协同效应，目前仍未阐述。
　　目的:
　　本实验对姜黄素是否具有增强ABT-737抗HepG2肝癌细胞增殖作用进行研究，同时，也对姜黄素是否通过诱导凋亡增强ABT-737抗HepG2肝癌细胞效应进行研究，进一步，对姜黄素是否通过ROS-ASK1-JNK氧化还原信号转导通路途径增强ABT-737诱导HepG2肝癌细胞凋亡进行探索。我们通过实验初步对姜黄素增强ABT-737对HepG2肝癌细胞的抗肿瘤效应及其可能机制进行探索，旨在为ABT-737以及姜黄素的进一步应用提供实验依据以及参考。
　　方法:
　　(1)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3大组:①ABT-737浓度梯度组:分别用0μM、1μM、5μM、10μM、15μM浓度梯度作用于HEPG2细胞;②姜黄素浓度梯度组:分别用0μM、2μM、4μM、6μM、8μM浓度梯度作用于HEPG2细胞;③联合用药组:选取姜黄素影响最小的浓度分别与0μM、1μM、5μM、10μM ABT-737联合作用于HEPG2细胞。用台盼蓝拒染实验检测各药物作用组中人肝癌细胞HEPG2的死亡率;CCK-8实验检测各药物作用组中人肝癌细胞HEPG2的增殖活性。
　　(2)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3组，即①1％DMSO溶剂对照组;②单用药组:ABT-73710μM组和姜黄素2μM组;③联合用药组:ABT-73710μM+姜黄素2μM组。Hoechst33258染色实验检测细胞凋亡情况;Caspase-3活性检测试剂盒检测各组细胞的Caspase-3活性;western blot法检测各组细胞中Bcl-2、Mcl-1、PARP、C-PARP、C-caspase-3蛋白的表达;活性氧检测试剂盒检测各组细胞中ROS水平。
　　(3)将人肝癌细胞HEPG2随机分为3大组:第一组分为10μM ABT-737+2μM姜黄素组和10μM ABT-737+2μM姜黄素+10μNAC组(ROS抑制剂);第二组分为10μM ABT-737+2μM姜黄素组和10μM ABT-737+2μM姜黄素+SP600125组(JNK抑制剂);第三组分为对照组，即转染空质粒载体，随后用10μM ABT-737+2μM姜黄素处理细胞和ASK1 siRNA组，即转染ASK1 siRNA，随后用10μMABT-737+2μM黄素处理细胞。分别用Hoechst33258染色实验、AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法以及Caspase-3活性检测试剂盒检测第一组细胞中细胞凋亡以及Caspase-3活性的变化。western blot法分别检测1％DMSO溶剂对照组、2μM姜黄素、10μM ABT-737和10μM ABT-737+2μM姜黄素组中p-JNK1和p-JNK2，JNK1和JNK2的表达;随后检测第一组细胞中p-JNK1和p-JNK2，JNK1和JNK2的表达。AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测第二组细胞的凋亡情况。台盼蓝拒染实验检测第三组细胞的死亡情况。
　　结果:
　　(1) ABT-737和姜黄素均对人肝癌HEPG2细胞活力具有明显抑制作用，且呈剂量依赖性(F=594.692，P=.000)，(F=422.147，P=.000);ABT-737和姜黄素均对人肝癌HEPG2细胞具有细胞毒作用，且呈剂量依赖性(F=1127.812，P=.000)，(F=1539.563，P=.000)。为排除实验干扰，我们选择对HEPG2细胞无显著影响的姜黄素浓度，即2μM进行实验，当不同浓度梯度ABT-737分别与2μM姜黄素配伍使用对人肝癌HEPG2细胞活力的抑制率以及细胞死亡率显著高于ABT-737相应浓度单用时，且当10μM ABT737与2μM姜黄素配伍时对HRPG2细胞活力的抑制率和死亡率最高，且呈剂量依赖性(F=799.555，P=.000),(F=1372.177, P=.000)。
　　(2) Hoechst33258实验结果显示，10μM ABT-737+2μM姜黄素组细胞的凋亡数量显著高于单用2μM姜黄素组或单用10μM ABT-737组。Caspase-3活性检测结果显示2μM姜黄素组中细胞的caspase-3活性无显著变化，10μMABT-737组中细胞的caspase-3活性稍增高，10μM ABT-737+2μM姜黄素组与10μM ABT-737组相比caspase-3活性显著增高(2.250±0.132，1.524±0.086，F=251.578，P=.000)。Western blot结果表明10μM ABT-737+2μM姜黄素组中C-caspase-3蛋白的含量较10μM ABT-737组显著增高(0.841±0.055，0.544±0.047，F=88.286，P=.000)。ROS检测结果表明，10μM ABT-737+2μM姜黄素组较10μM ABT-737组的ROS水平显著增高(2.257±0.088，1.231±0.068，F=566.789，P=.000)。
　　(3)当加入NAC（ROS抑制剂）后，10μMABT-737+2μM姜黄素对细胞凋亡的促进作用显著降低(26.417±2.714，15.540±1.587，t=14.640，P=.000)，Caspase-3活性亦显著下降（2.276±0.025，1.518±0.053，t=38.688，P=.000）。western blot实验结果显示，2μM姜黄素+10μM ATB-737较10μM ABT-737组更易使JNK蛋白活化（0.914±0.043，0.714±0.034，F=134.864，P=.000;0.907±0.078，0.710±0.039，F=71.176，P=.002）;当加入NAC后，2μM姜黄素+10μM ATB-737作用下细胞中活化的JNK蛋白表达量显著降低(0.717±0.093，0.924±0.079，t=2.942, P=0.042;0.767±0.078,0.918±0.039, t=4.121, P=0.015)。AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法结果表明，当加入SP600125(JNK抑制剂)后2μM姜黄素+10μM ATB-737作用下细胞的凋亡数量显著减少（25.326±2.122，14.450±1.625，t=14.983，P=.000）。当沉默细胞中ASK1后，2μM姜黄素+10μM ATB-737作用下细胞的死亡率显著降低(39.050±5.930，26.657±3.104，t=18.578，P=.000)。
　　结论:
　　姜黄素能够通过上调ROS水平，进而通过激活ROS-ASKI-JNK信号通路增效ABT-737诱导HEPG2细胞凋亡的作用。

目录

摘要

引言

第一章 姜黄素增效ABT-737抗肝癌细胞增殖作用

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 结果

1 CCK-8实验结果

2 台盼蓝拒染实验结果

三 讨论

四 小结

第二章 姜黄素增效ABT-737诱导肝癌细胞凋亡作用

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 实验结果

1 Hoechst 33258染色实验结果

2 Caspase-3活性检测结果

3 western blot检测结果

4 活性氧检测实验结果

三 讨论

四 小结

第三章 姜黄素经由活化ROS-ASK1-JNK通路增效ABT-737诱导肝癌细胞凋亡作用

一 材料与方法

1 材料

2 方法

二 实验结果

1 抗氧化剂NAC作用后对姜黄素+ABT-737配伍作用的影响

2 western blot检测结果

3 Annexin V-FITC／PI双染色法检测结果

4 台盼蓝拒染实验结果

三 讨论

四 小结

参考文献

综述 细胞凋亡分子机制研究进展

附件

成果

致谢

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