低氧调节Wnt-Notch通路串话及其对成骨细胞增殖影响的初步探讨

摘要

在许多骨科疾病，如骨折、关节炎、股骨头坏死以及骨肿瘤中，低氧环境是常见的细胞病理微环境之一。低氧微环境可引起细胞巨烈的生物学变化。在这些骨组织疾病中，成骨细胞是受到低氧环境影响的重要细胞类型之一。研究在低氧环境下成骨细胞信号转导调控的规律，有利于理解各类骨组织疾病发生发展的机制。创伤常导致血供的减少和低氧环境，在骨折部位，由于组织血流中断等诸多因素，使得骨折局部的氧浓度降低。在这种异常的低氧状态下，低氧诱导因子(hypoxia induced factor，HIF)途径是各种组织器官在对局部氧环境进行感受和应答过程中的核心途径。对氧平衡的调节能力是器官进行有氧代谢的关键特性。组织细胞为了适应低氧环境，其低氧调控调控基因会影响到众多发育、生理及病例过程，这使得氧敏感通路成为了一个极佳的再生药物调控靶点。低氧诱导因子(HIF)是调控细胞对低氧反应产生基因表达的主要转录因子。HIF调控基因涉及了血管生成、厌氧代谢、葡萄糖转运、细胞增殖、细胞生存/死亡、以及红细胞生成等诸多方面。
　　事实上，HIF-1除通过经典信号通路途径调节其下游靶基因外，还常常直接或间接地影响了其他保守信号通路的信号转导。本文中着重讨论的是HIF-1α及HIF信号通路对Wnt、Notch信号通路串话的影响。Wnt、Notch信号通路都是哺乳动物细胞内高度保守的信号通路，它们可参与到骨组织细胞的各类生理病理作用之中。
　　Notch信号通路是几乎存在于各类组织细胞中与分化相关的重要细胞信号通路。在骨骼系统的发育过程中，骨软骨前体细胞必需通过Notch信号来维持其多向分化能力以防止过早分化为成骨细胞。因此在许多病理状态下，过度激活Notch信号通路会抑制成骨细胞的成熟，造成骨发育不良。此外，软骨细胞的增生肥大和终末分化抑制更是离不开Notch信号通路的作用。在骨科疾病研究中发现，Notch信号通路在骨肉瘤和骨关节炎的发生发展中起到了重要作用。
　　另一方面，Wnt通路则是调控细胞增殖分化的重要信号通路。Wnt配体可通过β-catenin依赖性及β-catenin非依赖性信号通路对多种器官的发育和稳态维持产生重要影响。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在骨组织生长发育中起到了关键作用
　　由于在研究中发现Wnt与Notch通路相互联系非常紧密，以至于有研究者建议将其联系起来命名为“Wntch”通路。“Wntch”信号通路的主要作用是维持个体中组织细胞生长发育过程的正常进行。同时，“Wntch”的活性还能调节组织中干细胞、祖细胞及分化成熟细胞之间的平衡。
　　尽管有很多报道对HIF与Wnt、Notch信号通路的作用分别进行了研究，但很少有研究将Wnt、Notch信号通路串话的机制联系起来。事实上，作为信号通路调控的重要机制，在低氧环境及HIF-1作用环境下，Wnt-Notch通路的串话是否受到了影响同样是值得研究的问题。
　　在所有影响Wnt-Notch信号通路偶联的环境因素中，由于在多种病理性骨微环境中经常出现低氧的情况，低氧环境及低氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α，hif-1α)受到了广泛的关注。低氧不仅启动了低氧诱导因子hif-1α信号通路，而且还对骨发育生长中具有重要作用的其它信号通路产生了影响。其中便包括了Wnt及Notch信号通路等。根据一些报道中所述，hif-1α可通过各种直接或间接的方式引起Notch受体胞内区蛋白(Notch intraCellular Domain，NICD)水平的上升，从而使Notch信号通路的上调。然而，低氧及hif-1α对Wnt-Notch信号通路串话的作用仍然具有争议。特别地，在近期的一些实验中，对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞系进行低氧环境培养时，可观察到Wnt信号通路活性的下调。然而，Wnt信号通路在低氧作用下的调节方式及其分子机制仍未阐明。
　　目的:
　　从低氧对Wnt-Notch通路串话影响的角度，阐述低氧对成骨细胞增殖调控的一系列机制。以期较为合理地解释此前研究中所存在的诸多矛盾，为关于低氧对成骨作用影响的一系列研究提供进一步证据支持。
　　方法:
　　1.通过氯化钴化学诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1，建立化学细胞性低氧模型，并通过PCR及Western Blot等手段验证模型建立效果。
　　2.通过siRNA双链寡核苷酸对MC3T3-E1小鼠成骨细胞系进行瞬时转染，分别干扰β-catenin及Hif-1α的mRNA基因表达，并通过PCR验证干扰效率。
　　3.通过前期实验建立的低氧模型及β-catenin及Hif-1α基因干扰模型，利用CCK-8增殖活性检测及流式细胞凋亡检测等手段，观察低氧条件下成骨细胞的增殖情况;并通过PCR及Western Blot初步观察其分子水平变化，并探讨可能分子机制。
　　结果:
　　本研究通过一系列实验结果发现:在经过氯化钴处理条件下培养成骨细胞48h、72h后，成骨细胞的增殖能力下降，同时其凋亡率明显上升。通过对CCK-8及流式细胞术细胞凋亡率、存活率检测，确认了在Notch信号通路阻断状态下，氯化钴诱导的低氧条件可促进成骨细胞的增殖活性。并且在Notch信号通路抑制剂DAPT浓度一定的条件下，低氧所能促进的成骨细胞增殖程度与氯化钴浓度在一定范围呈正相关。在此基础上，实验进一步通过Western Blot检测Notch信号通路信使蛋白表达量，并通过q-PCR检测信号通路靶基因的表达水平，结果显示，在Notch信号受到阻断剂如DAPT等作用的情况下，随着氯化钴化学浓度的增高，Notch信号通路本身并未受到上调。
　　与Notch信号通路的情况不同的是，β-catenin的活性蛋白水平和Wnt信号通路靶基因的表达水平受到氯化钴模拟低氧刺激后有轻微上升。进一步在比较低氧下不同程度的Notch信号通路阻断环境中，β-catenin基因敲减状态的成骨细胞系(β-catenin KD)及野生型成骨细胞系(WT)之间的增殖能力时可发现，野生型成骨细胞的细胞增殖能力随Notch信号通路的阻断程度在一定范围内上升，而β-catenin基因敲减后的成骨细胞系的增殖能力随着Notch信号通路的阻断程度上升而受到了一定的抑制。
　　实验结果显示，当hif-1α基因表达敲减后，在Notch信号通路的阻断条件中，氯化钴模拟低氧不能导致Wnt信号的上调。相反地，随着Notch信号通路阻断程度的增强，β-Catenin蛋白水平及wnt信号通路靶基因的表达水平明显下降。同时，在hif-1α基因敲减后的成骨细胞系中，在Notch信号通路阻断的条件下，氯化钴的浓度对成骨细胞增殖无明显的影响。此外，通过在氯化钴模拟低氧的条件下，对野生型成骨细胞系及hif-1α基因敲减后成骨细胞系之间的比较，可发现当hif-1α基因敲减后，成骨细胞中NICD的表达量明显减少，
　　同时，为了验证γ-分泌酶抑制剂的应用意义，通过CCK-8试验对不同浓度DAPT对常氧环境下成骨细胞或低氧环境成骨细胞的增殖影响进行观察可发现，常氧条件下成骨细胞的增殖随DAPT浓度的增加而下降，而低氧状态下成骨细胞的增殖会随着DAPT浓度的上升在一定范围内逐渐上升。
　　结论:
　　本研究结果主要证明了低氧环境下Hif-1α可以诱导调控Wnt信号通路的变化。同时，低氧环境可诱导Notch信号通路的激活，由于Notch通路的激活可对Wnt信号通路的产生直接或间接的交互作用，使Wnt信号通路活性受到抑制，并同时抑制了细胞增殖能力。当Notch信号激活时，Wnt信号的活性会受到相对的抑制。因此，在低氧环境中，阻断Hif1α诱导的Notch信号通路激活过程，可解救低氧环境造成的Wnt信号活性下调。这一现象表明了在低氧环境中，Wnt-Notch信号通路串话在成骨细胞增殖中起到重要调节机制。
　　本研究证明Wnt-Notch信号串话在低氧环境下成骨细胞的生物学行为中，至少起到三方面的影响:1.低氧环境可不同程度地参与调节经典Wnt及Notch信号通路的活性，从而使得低氧环境中的Wnt-Notch信号通路串话作用更为明显，并以此调控细胞生物学行为;2.受低氧条件激活的Notch信号通路可抑制Wnt信号活性并抑制Wnt信号靶基因所诱导的成骨细胞增殖作用;3.靶向γ-分泌酶的药物可有效地调控Notch信号通路活性，并以此调控Wnt-Notch信号串话过程，因而可以在低氧环境中增强成骨细胞的增殖能力。
　　综上所述，本研究发现了关于低氧及Wnt-Notch信号通路串话之间的一些新的现象，并确认了低氧及hif-1α信号通路在这一特殊信号交互作用中的重要作用。同时，本研究的结果进一步解释了低氧环境对成骨细胞增殖的影响及其可能的机制，为阐明低氧微环境影响骨组织再生的病理分子机制提供了一定的研究基础与实验证据。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 小鼠成骨细胞体外氯化钴化学诱导低氧模型的建立

一、实验目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、实验讨论

第三章 siRNA瞬时转染干扰β-catenin及Hif-1α基因表达模型的建立

一、实验目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、实验讨论

第四章 低氧通过调节Wnt-Notch通路串话对成骨细胞增殖作用的影响及其机制的探讨

一、实验目的

二、实验材料

三、实验方法

四、实验结果

五、实验讨论

第五章 相关综述 Notch信号相关通路在调控骨增殖代谢及成骨分化中的作用机制研

第六章 全文总结

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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