MiR-124通过靶基因Bim调节MPTP帕金森病模型中细胞凋亡和自噬

摘要

本课题拟在MPTP帕金森病模型中研究miR-124的表达变化，并探讨其是否参与调节帕金森病中多巴胺能神经元凋亡和细胞自噬过程，是否具有神经保护作用及具体机制。
　　第一章 miR-124在MPTP诱导的帕金森病模型中的表达及意义
　　目的:检测MPTP诱导的帕金森病小鼠和MPP+处理的SH-SY5Y细胞中miR-124的表达
　　方法:(1) MPTP连续腹腔注射5天构建帕金森病小鼠模型，按最后一次注射MPTP后的不同时间点分组，收集各组小鼠中脑组织，提取总RNA，逆转录为cDNA，RT-PCR扩增miR-124和U6。
　　结果:相比于正常组小鼠，MPTP给药后所有时间点的小鼠中脑组织内的miR-124表达水平均显著性下降，miR-124原位杂交结果显示在MPTP帕金森病小鼠中脑保留的多巴胺能神经元内的miR-124信号更弱。
　　结论:在MPTP诱导的帕金森病模型中，多巴胺能神经元的miRNA-124表达在早期即发生了显著性下降。
　　第二章 外源性miRNA-124对MPTP诱导的帕金森病的神经保护作用
　　目的:探讨miR-124是否对MPTP帕金森病小鼠具有神经保护作用。
　　方法:以miR-124激动剂在小鼠体内过表达miR-124，在MPTP注射前9天侧脑室置管，1周后开始经导管注射miR-124激动剂，2天后再开始腹腔注射MPTP，实验分为正常小鼠组，正常小鼠阴性对照剂组，MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组，MPTP帕金森病小鼠miR-124激动剂组，同样在不同时间点收集中脑组织。以TH免疫组织化学染色评估黑质区多巴胺能神经元的数量，以高效液相色谱测定中脑组织多巴胺含量。
　　结果:经侧脑室注射miR-124后，相比于MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组，MPTP帕金森病小鼠激动剂组内的miR-124水平均显著升高。相应地，TH免疫组织染色信号显著增强;
　　结论:miR-124能有效的减轻MPTP帕金森病小鼠中脑黑质区多巴胺能神经元的缺失，减少中脑组织内多巴胺含量的下降，对于MPTP诱导的帕金森病小鼠有神经保护作用。
　　第三章 Bim是miR-124的一个靶基因
　　目的:预测并验证miR-124的靶基因。
　　方法:(1)以Target Scan预测miR-124的靶基因;(2)构建靶基因野生型和突变型荧光素酶报告质粒，将质粒和miR-124模拟物或阴性对照剂同时转染入HEK293细胞，48小时后读取荧光值，实验分为野生型质粒miR-124阴性对照剂组、野生型质粒miR-124模拟物组、突变型质粒miR-124阴性对照剂组和突变型质粒miR-124模拟物组;
　　结果:(1) TargetScan软件分析，发现人Bim的mRNA3'端非编码序列内有两个miR-124的结合位点，且在物种间高度保守;(2)荧光素酶报告基因系统发现miR-124与Bim基因的3'端非编码区相结合，相比于野生型质粒miR-124阴性对照剂组，野生型质粒miR-124模拟物组的荧光素酶效应显著下降;
　　结论:Bim基因是miR-124的一个靶基因，其表达受miR-124的调控。
　　第四章 miR-124通过Bim基因减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元的凋亡及其机制
　　目的:探讨miR-124是否能减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元的凋亡，并阐明具体机制。
　　方法:在MPTP注射前9天侧脑室置管，1周后开始经导管注射miR-124激动剂，2天后再开始腹腔注射MPTP，实验分为正常小鼠组，正常小鼠阴性对照剂组，MPTP帕金森病小鼠阴性对照剂组，MPTP帕金森病小鼠miR-124激动剂组，收集MPTP注射后1天后各组的中脑组织，提取总RNA，逆转录成eDNA，RT-PCR定量分析Bim基因的表达;收集MPTP注射4天后各组的中脑组织，分别提取总蛋白和线粒体蛋白，采用Western blot分析Bim、Puma、Noxa和Bid蛋白的表达和Bax蛋白在线粒体的表达，另外采用TH免疫组织染色联合尼氏染色，依靠凋亡细胞的形态学特征对中脑黑质区的凋亡细胞计数。
　　结果:(1)相比于正常组小鼠，MPTP组小鼠一天后Bim基因mRNA增加了75％左右(1 vs1.757)。而在MPTP模型组内，相比于阴性对照剂，miR-124激动剂能显著下降Bim mRNA的表达水平(1.757±0.213 vs1.226±0.118，95％置信区间:-1.046～-0.0153)。(2) MPTP造模引起了Bim蛋白表达水平显著升高，并且miR-124激动剂则能显著减少MPTP引起的Bim蛋白表达增加(3.106±0.245 vs1.947±0.344，95％置信区间-2.022～-0.2966);MPTP并不能引起BH3-only蛋白Puma和Noxa的表达变化，只有Bid在MPTP造模后表达上升，但是miR-124激动剂并不能拮抗MPTP引起的Bid表达上升。
　　结论:外源性补充miR-124能减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元凋亡，其机制为通过特异性的抑制Bim的表达，进而减少Bax蛋白向线粒体转位，减轻线粒体外膜渗透，最终抑制神经元凋亡。
　　第五章 miR-124调节MPTP帕金病中自噬功能障碍及机制
　　目的:研究miR-124是否能调节MPTP帕金病中自噬功能障碍，并研究其是否通过靶基因Bim起作用。
　　方法:(1) MPTP帕金森病模型构建及分组，侧脑室注射miR-124激动剂方法同前，收集最后一次注射MPTP1天后各组的中脑组织，裂解组织提取总蛋白，以western blot分析自噬体分子标记LC3Ⅱ和溶酶体分子标记LAMP1的表达。(2)设计Bim特异性siRNA，将对照剂，miR-124和si-Bim转染进SH-SY5Y细胞6小时后，以PBS或者MPP+处理细胞24小时后，收集细胞，提取RNA行qRT-PCR实验检测Bim的表达，同时提取总蛋白和溶酶体蛋白，分别检测总蛋白中LC3Ⅱ、LAMP1的表达和溶酶体内Bax蛋白的表达，以lysotracker-red标记溶酶体以评估溶酶体膜渗透。(3)以1mM MPP+或者PBS处理SH-SY5Y24小时，收集细胞，提取总蛋白，以Beclin-1抗体免疫沉淀蛋白样品，western blot检测Bim表达，以评估Beclin-1与Bim的相互作用。
　　结果:①相比于正常小鼠，MPTP帕金森病模型组小鼠中脑组织LC3Ⅱ蛋白表达显著增加（1±0 vs6.407±0.578）;在MPTP模型组内，相比于阴性对照剂，miR-124激动剂能显著减少LC3Ⅱ蛋白表达（6.407±0.578 vs3.7±0.684;95％置信区间-4.461～-0.9525）。同样地，MPTP减少了40％左右溶酶体分子标记LAMP1的表达(1±0vs0.620±0.064)，miR-124激动剂能显著降低溶酶体的缺失（0.620±0.064 vs0.927±0.047;95％置信区间0.1295～0.4838）;②相比于正常组细胞，siRNA-Bim和miR-124模拟物对Bim都有显著的基因沉默作用(control vs miR-124模拟物，1±0vs0.5068±0.07661，95％置信区间0.1992～0.7871; control vs siRNA-Bim,1±0 vs0.3856±0.09973,95％置信区间0.3204～0.9083）。在MPP+刺激下，siRNA-Bim和miR-124模拟物都能显著减少MPP+刺激引起的Bim表达上升（control vs miR-124模拟物，2.185±0.3350 vs1.232±0.1711，95％置信区间0.05941～1.847; control vssiRNA-Bim，2.185±0.3350 vs0.6610±0.06937，95％置信区间0.6301～2.418);
　　结论:miR-124在MPTP帕金森病模型中通过抑制Bim蛋白的表达，减少Bax蛋白的溶酶体转位，从而减轻溶酶体膜渗透，减少溶酶体缺失和自噬体堆积，改善MPTP引起的细胞自噬功能紊乱，起到神经保护的作用。
　　第六章 miR-124参与维持SH-SY5Y细胞内的基础自噬水平
　　目的:探讨在SH-SY5Y细胞内抑制miR-124后细胞基础自噬水平的变化。
　　方法:在SH-SY5Y细胞转染miR-124抑制剂或阴性对照剂24小时后，收集细胞行Western blot或者电镜检测细胞基础自噬水平。
　　结果:相比于阴性对照记组，miR-124抑制剂组Bim蛋白表达显著升高(1±0 vs1.370±0.07234，p=0.0362);细胞内自噬体分子标记LC3Ⅱ表达显著减少(1±0 vs0.68±0.07095，p=0.0458）;电镜观察发现在miR-124抑制剂组内自噬体样的膜状结构数量减少。
　　结论:正常SH-SY5Y细胞内内，抑制miR-124的表达后，Bcl2家族蛋白Bim表达升高，从而抑制了SH-SY5Y细胞的基础自噬水平。

目录

摘要

前言

第一章 miR-124在MPTP诱导的帕金森病模型中的表达及意义

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 外源性miRNA-124对MPTP诱导的帕金森病的神经保护作用

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 Bim是miR-124的一个靶基因

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 miR-124通过Bim基因减轻MPTP帕金森病小鼠中脑多巴胺能神经元的凋亡及其机制

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2 实验结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 miR-124调节MPTP帕金病中自噬功能障碍及机制

5．1 实验材料同第一章

5．2 实验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 miR-124参与维持SH-SY5Y细胞内的基础自噬水平

6．1 实验材料同第一部分

6．2 实验方法

6．3 实验结果

6．4 讨论

6．5 小结

全文小结

参考文献

中英文对照缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

声明