PEMF调控Ca2+/Calcineurin/NFATc1信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞分化

摘要

目的:
　　本文首先进行体外研究，采用小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞构建细胞模型，添加细胞核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclearfactor-kappa B ligand，RANKL)为刺激条件，诱导其向破骨细胞分化，因为体外实验具有直接可控的优点，尝试阐明下述问题:第一，PEMF可否对RANKL诱导的RAW264.7破骨分化的过程产生抑制作用;第二，RAW264.7细胞内钙离子信号在PEMF影响下的变化情况;最后，依据细胞信号转导理论，讨论RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中PEMF的作用靶点，是否与抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1细胞信号通路有关。
　　方法:
　　1.实验设计与分组
　　分别设置空白对照组（Control），RANKL单独诱导组(RANKL)，低频脉冲电磁场单独照射组(PEMF)，RANKL诱导组+低频脉冲电磁场(RANKL+PEMF)，RANKL诱导组+硝苯地平（RANKL+Nife），RANKL诱导组+内质网钙释放阻断剂(RANKL+SKF-96365)，RANKL诱导组+他克莫司（RANKL+FK506），RANKL诱导组+低频脉冲电磁场+硝苯地平(RANKL+PEMF+Nife)，RANKL诱导组+低频脉冲电磁场+他克莫司(RANKL+PEMF+FK506)检查不同组破骨分化特异型标志物、基因、蛋白及钙离子表达;
　　2.实验内容
　　2.1 PEMF对RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响
　　2.1.1 PEMF对RAW264.7细胞生物学特性的作用
　　应用CCK-8试剂盒检测LEPMF(50Hz，1mT)对RAW264.7细胞分化过程中的影响。
　　2.1.2 破骨细胞分化基因蛋白的表达与检测
　　传代培养RAW264.7细胞，RANKL(50ng/ml)，PEMF（置于37℃，5％二氧化碳孵箱中照射3h/d）刺激4天。TRAP染色实验，骨片吸收陷窝实验，Western blot以及RT-PCR检测不同实验条件下，破骨分化基因、蛋白以及特异性标志物的表达情况。
　　2.2 PEMF对RANKL诱导的RAW264.7细胞内钙离子信号的影响
　　钙离子荧光探针Fluo4-AM(10μM)，标记RANKL刺激24h后的各组RAW264.7细胞，避光30min，激光共聚焦显微镜测定各组钙离子变化情况。
　　2.3 PEMF对Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信号通路的调节
　　采用试剂盒测定Calcineurin蛋白活性，加入特异性信号通路阻滞剂后上述手段检测钙离子变化、Calcineurin蛋白表达，NFATc1核转位情况及破骨分化特异性蛋白组织蛋白酶K的表达。
　　3.统计分析
　　数据分析采用SPSS19.0统计软件进行，所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示，单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析其余数据，方差齐性时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett's T3法，组间两两比较采用t检验。设置P＜0.05表示为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.PEMF抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化
　　1.1 CCK-8细胞增殖实验
　　我们发现，各处理组在破骨分化过程的不同时间段对RAW264.7细胞的生存率影响无统计学意义(不同时间点F值分别为2.961、0.521、0.560、0.604/0.590，P值分别为0.127、0.642、0.697、0.675、0.681)上述结果表明:RAW264.7细胞体外增殖活性不受PEMF干预，后续实验的进行也在此基础之上。
　　1.2 PEMF导致破骨分化相关基因蛋白及标志物的表达水平下降
　　我们观察了破骨分化过程中2天和4天时，不同实验组对RAW264.7细胞TRAP、MMP9、NFAT及CTSK基因及蛋白水平的影响，结果表明:与Control组比较，分化过程中2d和4d的WB和PCR显示，RANKL组各类破骨分化基因及蛋白的表达均显著升高，而RANKL+PEMF组可以降低上述各类基因及蛋白的表达水平（F值及P值见表1-4、1-5）;各类蛋白在不同时间点之间的检测结果证实，随时破骨细胞分化过程的进行，其相应基因及蛋白的表达均有增加，但并非均有显著差异。TRAP染色检测结果显示:与RANKL组相比较，RANKL+PEMF组TRAP染色阳性细胞数目明显减少，多核巨细胞数量少，TRAP活性低。（F=83.69，P＜0.0001）骨片吸收陷窝面积测定结果显示:RANKL+PEMF组骨片吸收面积较RANKL组显著降低。(F=55.06，P＜0.0001)
　　2.PEMF抑制RAW264.7细胞内钙离子变化
　　在施加RANKL刺激24小时后的RAW264.7细胞，本文测定了不同实验条件下细胞内钙离子变化的影响，结果显示:与Control组比较，RANKL组能引起细胞内钙离子发生变化，产生钙振荡，PEMF组(0.322±0.012)可使细胞内发生钙振荡的细胞数比例显著下降(F=40.62，P＜0.0001)然而RANKL+Nife（0.293±0.009）与RANKL+SKF-96365组(0.221±0.006)处理同样可以产生PEMF的效果，使细胞钙振荡出现下降的趋势，且三者之间无统计学差异，上述结果说明:PEMF对细胞内钙离子变化均有调控作用，但具体作用位点仍期待进一步探索。
　　3.PEMF抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信号通路
　　在培养的RAW264.7细胞上，我们观测了PEMF对Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信号通路的影响，结果显示:Calcineurin蛋白表达水平在不同处理组之间无统计学差异(F=1.893，P=0.217)，但Calcineurin的活性检测结果表明，与Control组相比，RANKL组显著增高Calcineurin的活性，具有统计学差异(F=9.075，P=0.026)，但Calcineurin的蛋白水平仅具有上升的趋势，不具有统计学意义。接着我们测定了NFATc1的细胞核转位情况，结果显示:RANKL组的胞质c-NFATc1蛋白降低(F=27.38，P＜0.001)，具有统计学意义，而核蛋白n-NFATc1显著增加（F=11.92，P=0.003）。PEMF组细胞的Calcineurin的活性及NFATc1蛋白转位无显著影响，但PEMF对RANKL诱导的Calcineurin的活性升高均有显著的抑制作用。结果显示:与RANKL组比较，RANKL+PEMF组的Caleineurin的活性降低，差异具有统计学意义。核蛋白n-NFATc1减少，胞质蛋白c-NFATc1显著升高。此外，在特异性信号通路阻滞剂作用下，结果表明:RANKL+Nife组与RANKL+FK506组较RANKL组，Calcineurin的活性及破骨分化蛋白表达水平均显著降低（FCTSK=3.184，P=0.031;FNFATC1=9.682，P＜0.001），表明Ca+-Calcineurin-NFATc1信号通路确实参与破骨分化，而二者加上PEMF刺激后，上述蛋白表达进一步出现下降趋势，表明PEMF通过调控Ca2+-Calcineurin-NFATc1信号通路抑制破骨细胞分化。
　　结论：
　　1.体外环境下，PEMF可抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化，并抑制其骨吸收作用。
　　2.PEMF可降低RAKKL活化的RAW264.7细胞内钙离子信号表达。
　　3.PEMF抑制Calcineurin/NFATc1破骨分化信号通路，抑制破骨细胞分化的发生发展。

目录

摘要

前言

实验材料与实验方法

一、主要实验试剂及配制

三、主要实验仪器

第一部分 PEMF抑制RANKL诱导的RAW264．7细胞向破骨细胞分化

一、实验方法

二、实验结果

第二部分 PEMF对RAW264．7细胞内钙离子信号的影响

一、实验方法

二、实验结果

第三部分 PEMF抑制Calcineurin-NFATc1信号通路

一、实验方法

二、结果

讨论

结论

参考文献

中英文缩写词对照表

攻读学位期间研究成果

致谢

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