靶向沉默Wip1基因协同放疗对体外培养胶质瘤细胞的影响研究

摘要

胶质瘤占原发性颅内恶性肿瘤的80％，具有高度的侵袭性，且易复发。随着神经外科手术技术和肿瘤学的不断进步，手术结合放化疗已经成为胶质瘤的常规治疗方案，但是其预后仍然不容乐观，对人类的生命健康造成了严重的困扰。
　　野生型p53诱导的磷酸酶1（Wild-type p53-induced phosphatase1，Wip1）属于蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase2C，PP2C)家族，由PPM1D基因编码，单体结构，对冈田酸不敏感。Wip1基因是一个癌基因，促进肿瘤的发生、发展和侵袭，对肿瘤细胞的增殖、凋亡以及应激损伤的修复产生重要影响。研究证实，不同p53状态的胶质瘤细胞对于放疗的敏感性不同，而Wip1又由p53诱导，且Wip1在应对不同程度的应激损伤时其表达量也有差异，因此推测，Wip1可能影响胶质瘤细胞对放疗的敏感性，且Wip1基因的沉默协同放疗可能会对细胞的增殖能力产生影响。
　　细胞周期检验点激酶1(checkpoint kinase1，Chk1)和细胞周期检验点激酶2(checkpoint kinase2，Chk2)都是Wip1作用的下游靶点，对细胞的正常生存均有重要意义，可以调控细胞的细胞周期、凋亡、和增殖。有研究证实，Chk1和Chk2的表达可以影响肿瘤细胞放疗后的增殖能力，因此如果Wip1基因沉默协同放疗可以对胶质瘤细胞的增殖能力产生影响，则可能是通过调节Chk1和Chk2的表达来实现。
　　本研究主要通过构建胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型并协同放疗阐释Wip1基因在胶质瘤细胞放疗抵抗中的作用，以及Wip1基因沉默协同放疗对细胞增殖能力影响的作用机制，为提高胶质瘤的治疗效果提供坚实的理论基础。
　　全文分为三个部分:
　　第一章 胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型的建立及协同放疗对U-251胶质瘤细胞增殖影响的研究
　　第二章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk1表达变化的研究
　　第三章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk2表达变化的研究
　　以均数±标准差((x)±S)的形式表示计量资料。使用SPSS19.0软件对数据进行分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对两个组间的差异进行比较，多重比较采用LSD检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　第一章 U-251胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型的建立及协同放疗对胶质瘤细胞增殖影响的研究
　　目的:
　　构建U251胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型，研究Wip1基因沉默协同放疗对胶质瘤细胞增殖的影响。
　　方法:
　　培养U-251细胞，使用慢病毒感染U251细胞，构建U251细胞Wip1基因沉默模型，荧光显微镜下观察细胞感染效率。细胞的Wip1基因被有效沉默后，对细胞进行放疗干预。根据干预方式，将细胞如下分组:Wip1沉默放疗组（IR+Wip1-）、Wip1沉默组(Wip1-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。对干预后的各组细胞采用CC8法检测细胞增殖。
　　结果:
　　1.使用慢病毒感染U-251细胞3-4d后，采用荧光倒置显微镜对细胞进行观察，根据绿色荧光蛋白表达情况来确定感染效率，以绿色荧光表达的细胞占总细胞90％以上为感染成功。结果显示感染效率均90％以上。
　　2.Wip1基因沉默协同放疗处理后细胞增殖明显下降:U-251细胞Wip1基因被有效沉默并放疗后，对各组细胞增殖情况采用cck-8法检测，细胞增殖速率由低到高依次为Wip1沉默放疗组、Wip1沉默组、单纯放疗组、阴性对照未放疗组，随着时间的延长，以上4组差异逐渐增大，第24h(P＜0.05)、48h(P＜0.05)、72h(P＜0.05)、96h(P＜0.05)、120h(P＜0.05)各个时间点组间差异均有统计学意义。放疗后第24h、48h、72h、96h、120h五个时间点，单纯放疗组和Wip1沉默组的增殖率均显著低于阴性对照未放疗组(P＜0.05)，差异有统计学意义。第24h、72h、96h、120h四个时间点，Wip1沉默放疗组细胞增殖率低于单纯放疗组(P＜0.05)、Wip1沉默组(P＜0.05)和阴性对照未放疗组(P＜0.05)，差异有统计学意义。放疗后第48hWip1沉默放疗组增殖率低于单纯放疗组(P＜0.05)和阴性对照未放疗组(P＜0.05)，差异有统计学意义。
　　结论:
　　采用慢病毒载体构建成功构建U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型，单纯Wip1基因沉默和单纯的放疗均可显著降低U251细胞的增殖能力，而Wip1基因沉默协同放疗处理的细胞，增殖能力又显著低于单纯放疗和单纯Wip1基因沉默处理的细胞，Wip1的基因表达影响胶质瘤的放疗抵抗。
　　第二章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk1表达变化的研究
　　目的:
　　通过靶向Wip1基因沉默协同放疗，检测Chk1的mRNA和蛋白的表达变化，研究Wip1基因沉默协同放疗降低胶质瘤细胞增殖能力的作用机制。
　　方法:
　　细胞的Wip1基因被有效沉默后，对细胞进行放疗干预。根据干预方式，将细胞如下分组:Wip1沉默放疗组(IR+Wip1-)、Wip1沉默组(Wip1-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。放疗后24小时提取细胞RNA和蛋白，采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测Chk1的mRNA和蛋白的表达量。
　　结果:
　　采用荧光实时定量Q-PCR检测Chk1的mRNA表达情况。Chk1的mRNA表达以NC组作为对照组表达量为1，IR+Wip1-组、Wip1-组、IR组的Chk1 mRNA的相对表达量依次为1.712±0.057、2.914±0.087、0.815±0.018，组间差异显著(P＜0.05)，有统计学意义。Wip1-组高于NC组(p＜0.05)，IR组低于NC组(p＜0.05)，IR+Wip1-组相对Wip1-组表达降低(p＜0.05)，但高于NC组和IR组(p＜0.05)，差异有统计学意义。
　　结论:
　　对U-251细胞靶向沉默协同放疗后，细胞的Chk1 mRNA表达相对升高，而蛋白表达降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chk1的蛋白表达实现对胶质瘤增殖的抑制。
　　第三章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk2表达变化的研究
　　目的:
　　通过靶向Wip1基因沉默协同放疗，检测Chk2的mRNA和蛋白的表达变化，研究Wip1基因沉默协同放疗降低胶质瘤细胞增殖能力的作用机制。
　　方法:
　　细胞的Wip1基因被有效沉默后，对细胞进行放疗干预。根据干预方式，将细胞如下分组:Wip1沉默放疗组(IR+Wip1-)、Wip1沉默组(Wip1-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。放疗后24小时提取细胞RNA和蛋白，采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测Chk1的mRNA和蛋白的表达量。
　　结果:
　　各组U-251细胞Chk2的mRNA实时荧光定量Q-PCR检测结果
　　采用荧光实时定量Q-PCR检测Chk2的mRNA表达情况。Chk2的mRNA表达以NC组作为对照组表达量为1，IR+Wip1-组、Wip1-组、IR组的Chk2 mRNA的相对表达量依次为0.541±0.057、0.739±0.036、0.777±0.016，组间差异显著(P＜0.05)，差异有统计学意义。Chk2的mRNA表达，IR组、Wip1-组和IR+Wip1-组显著低于NC组(P＜0.05)，差异有统计学意义，而IR+Wip1-组的Chk2 mRNA又分别低于IR组(P＜0.05)和Wip1-组(P＜0.05)，差异有统计学意义。
　　结论:
　　对U-251细胞靶向沉默协同放疗后，细胞的Chk2 mRNA和蛋白表达均降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chk2的mRNA和蛋白表达来抑制胶质瘤细胞的增殖能力。
　　全文结论:
　　1)通过采用慢病毒感染U-251细胞，成功构建U-251细胞Wip1基因沉默模型。
　　2)Wip1基因沉默协同放疗干预后的U-251细胞的增殖能力显著下降，说明Wip1基因沉默协同放疗可以显著抑制胶质瘤细胞的增殖，Wip1基因是导致细胞放疗抵抗的重要因素。
　　3)Wip1基因沉默协同放疗后，Wip1的下游作用靶点Chk1的mRNA表达显著升高，而蛋白表达降低;Wip1基因沉默协同放疗可通过影响Chk1的蛋白表达实现对胶质瘤增殖的抑制。
　　4)Wip1基因沉默协同放疗后，Wip1的下游作用靶点Chk2的mRNA和蛋白表达均降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chk2的mRNA和蛋白表达来抑制胶质瘤细胞的增殖能力。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型的建立及协同放疗对胶质瘤细胞活性影响的研究

1．1 材料与方法

1．1．1 主要仪器设备

1．1．2 主要试剂及材料

1．1．3 相关试剂配制

1．1．4 U251细胞系的复苏、传代、冻存

1．1．5 慢病毒感染U251细胞

1．1．6 放疗干预

1．1．7 CCK8检测细胞增殖

1．2 结果

1．2．1 构建U-251细胞Wip1基因沉默模型

1．2．2 CCk8法检测U-251细胞增殖能力

1．3 讨论

参考文献

第二章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk1表达变化的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 主要仪器设备与试剂

2．1．2 主要试剂及材料

2．1．3 U251细胞系的复苏、传代、冻存

2．1．4 慢病毒感染U251细胞

2．1．5 放疗干预

2．1．6 荧光实时定量PCR检测U-251细胞Chk1的mRNA表达情况

2．1．7 免疫印迹检测U-251细胞Chk1蛋白表达情况

2．1．8 数据分析及统计学处理

2．2 结果

2．2．1 采用Q-PCR检测U-251胶质瘤细胞Chk1的mRNA表达情况

2．2．2 采用免疫印迹检测细胞Chk1的蛋白表达情况

2．3 讨论

参考文献

第三章 靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk2表达变化的研究

3．1 材料与方法

3．1．1 主要仪器设备与试剂

3．1．2 主要试剂及材料

3．1．3 U251细胞系的复苏、传代、冻存

3．1．4 慢病毒感染U251细胞

3．1．5 放疗干预

3．1．6 荧光实时定量PCR检测U-251细胞Chk2的mRNA表达情况

3．1．7 免疫印迹检测U-251细胞Chk2蛋白表达情况

3．1．8 数据分析及统计学处理

3．2 结果

3．2．1 采用Q-PCR检测U-251胶质瘤细胞Chk2的mRNA表达情况

3．2．2 采用免疫印迹检测细胞Chk2的蛋白表达情况

3．3 讨论

参考文献

全文结论

综述 Wip1及其下游靶点Chk2与脑肿瘤的研究进展

附录

成果

致谢

声明