基于磁珠固相载体的时间分辨荧光免疫分析技术平台的建立及临床应用

摘要

近年来在免疫检测行业内开发出的磁珠与传统的酶联免疫分析及化学发光免疫分析相结合形成的磁珠酶联免疫分析技术、磁珠化学发光免疫分析技术，该技术已广泛开展并应用至临床疾病检测。据文献报道和市场调研，目前市面上基于时间分辨荧光免疫分析技术的试剂依旧基于传统的微孔板式免疫分析，并且在结合免疫磁珠和时间分辨荧光免疫分析技术应用于临床疾病标志物分子检测方面缺少全面而准确的系统性研究。
　　鉴于此，本研究对基于磁珠新型载体的免疫分析平台进行全面而准确的临床应用评估。对血清中不同类型的蛋白分子（包括大分子抗原抗体、半抗原及小分子单价抗原）而采用不同的反应模式进行研究，根据待测物的性状及检测的具体条件而设计不同的检测模式，包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法等。本实验采用乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)及e抗原(Hepatitis B eantigen，HBeAg)、乙型肝炎病毒表面抗体(Antibody tohepatitis B surface antigen，anti-HBs)、游离甲状腺素(Free Thyroxine，FT4)三种在方法学上具有代表性的血清标志物，分别对双抗体夹心法、双抗原夹心法以及竞争法三种不同的反应模式进行可行性分析。本课题实验内容主要分为三大部分:(1)采用双抗体夹心反应模式，研制HBsAg和HBeAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂;(2)采用双抗原夹心反应模式，研制抗-HBs磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂;(3)采用直接竞争反应模式，研制FT4磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂。实验设计上涵盖:(1)摸索不同粒径、不同化学基团修饰的磁珠连接蛋白，选取合适的磁珠作为固相载体并且优化连接工艺和镧系稀土元素螯合物标记蛋白;(2)反应体系的建立和优化，并通过优化的反应体系对试剂的各项性能指标作出全面而整体的评价，包括准确度、分析灵敏度、检测范围、剂量-反应曲线、特异性、精密度、抗干扰性和稳定性分析;(3)用自制试剂与国外同类进口诊断试剂进行平行比对，评价其初步应用于临床诊断的可行性。利用磁珠作为固相载体建立的时间分辨反应体系所具有的快速、小样品量、检测范围宽、高灵敏度、小型化等特点极大满足临床随诊检测的需要，将使其具有更广阔的临床应用前景。
　　实验一研究结果:(1)自制HBsAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下，分析灵敏度为0.02 IU/mL，线性范围达0.2～700 IU/mL。检测国家参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.925～1.067之间，分析内和分析间变异系数分别在为4.7％～8.7％和3.8％～7.5％之间，符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBeAg、HBcAg、 HCV、HIV、TP、RF阳性样品用本试剂测定，无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制HBsAg试剂与雅培公司化学发光试剂对399份血清样本进行平行比对实验，临床特异性和敏感性符合率均100％，经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=1（双侧）;κ系数检验结果，κ=1，P=0.000，说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将231份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析，相关方程为:Y=1.182X-0.017，相关系数r=0.989，P＜0.001。经上述统计学处理结果表明，两种检测方法吻合度有统计学意义，临床血样测值均具有显著相关性。(2)自制HBeAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下，分析灵敏度为0.021 PEI U/mL，线性范围达0.4～160 PEI U/mL。检测国际参考品不同稀释比例样品的实测浓度与期望浓度的比值在0.942～0.978之间，分析内和分析间变异系数分别在为2.8％～4.3％和4.2％～6.0％之间，符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBsAg、 HBcAg当作样品用本试剂测定，无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对257份血清样本进行平行比对实验，临床特异性和敏感性符合率均分别为95.8％和98.9％，经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=1（双侧）;κ系数检验结果，κ=0.951，P=0.000，说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将184份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析，相关方程为:Y=1.002X-0.333，相关系数r=0.974，P＜0.001。经上述统计学处理结果表明，两种检测方法吻合度有统计学意义，临床血样测值均具有显著相关性。
　　实验二研究结果:自制抗-HBs磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下，分析灵敏度为0.45 mIU/mL，线性范围达2～600 mIU/mL。检测自制参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.964～1.018之间，分析内和分析间变异系数分别在为2.4％～4.3％和3.5％～5.0％之间，符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBeAb、HBcAb当作样品用本试剂测定，无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对269份血清样本进行平行比对实验，临床特异性和敏感性符合率均分别为96.3％和98.1％，经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=0.687（双侧）;κ系数检验结果，κ=0.932，P=0.000，说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将210份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析，相关方程为: Y=0.934X+2.511，相关系数r=0.988，P＜0.001。经上述统计学处理结果表明，两种检测方法吻合度有统计学意义，临床血样测值均具有显著相关性。
　　实验三研究结果:自制FT4磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下，分析灵敏度为0.47 pmol/L，线性范围达2～200 pmol/L。检测自制参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.934～0.973之间，分析内和分析间变异系数分别在为2.7％～4.3％和4.0％～7.0％之间，符合试剂鉴定要求。将高浓度的T3、FT3、rT3当作样品用本试剂测定，无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。自制试剂通过对240份健康查体者血清FT4进行分析，确定正常人参考值范围为11.0～25.0 ng/mL。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对202份血清样本进行平行比对实验，经配对卡方检验，符合率达到99.0％，血样测定结果分别设为为横坐标和纵坐标做线性相关分析，相关方程为:Y=0.986X+0.037，相关系数r=0.980，P＜0.001。经上述统计学处理结果表明，两种检测方法吻合度有统计学意义，临床血样测值均具有显著相关性。
　　综上所述，本研究利用磁珠作为固相载体结合时间分辨免疫分析技术，成功研发出基于双抗体夹心、双抗原夹心及竞争法反应模式的试剂，用于检测人血清中HBsAg、 HBeAg、抗-HBs及FT4四种不同血清分析物。经评价，磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂的各项指标（准确度、灵敏度、精密度、特异性、抗干扰性等）均满足临床检测试剂要求，与同类进口试剂比较，其临床特异性和敏感性均无显著差异，线性相关分析具有显著相关性。本文全面而准确地系统性阐述了磁珠作为固相载体能够提高检测灵敏度，扩大线性范围，缩短分析时间，提高检测效率等优点，表明了基于磁珠的时间分辨荧光免疫分析平台应用于临床疾病标志物检测的可行性，有望通过进一步优化应用于生产，开发出符合临床分子诊断和食品环境微量物质检测等需求的免疫分析试剂，对标记免疫分析技术的开拓与发展具有非常重要的意义。

目录

摘要

前言

第一章 双抗体夹心法——HBsAg与HBeAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂的研制

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果与讨论

1．4 材料

1．5 方法

1．6 结果与讨论

1．7 讨论与小结

第二章 双抗原夹心法——抗-HBs磁珠时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果与讨论

2．4 讨论与小结

第三章 竞争法——FT4磁珠时间分辨荧光免疫分析检测试剂的研制

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果与讨论

3．4 讨论与小结

第四章 研究成果与展望

参考文献

中英文缩略词

攻读学位期间成果

致谢

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