miR-365靶向下调BAX抑制凋亡促进皮肤鳞状细胞癌发生发展的初步研究

摘要

目的:
　　非黑色素瘤皮肤癌(Non-melanoma skin cancer，NMSC)是人类常见的恶性肿瘤之一，包括基底细胞癌(Basal cell carcinoma，BBC)和鳞状细胞癌(squamouscell carcinoma of skin，SCC)等。SCC是源于上皮组织中角质形成细胞的恶性肿瘤，包括宫颈癌、食道癌和皮肤鳞状细胞癌等(squamous cell carcinoma of skin，CSCC)。CSCC是发生在表皮（或粘膜）上皮细胞的一种恶性肿瘤，它的发病率低于基底细胞癌，但是转移率和死亡率较高，男性发病多于女性，好发于脸部、手部和前臂。已有的报道microRNAs参与CSCC发生发展。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA小分子，microRNA与靶mRNA的3'UTR部分序列特异性碱基配对，会抑制靶基因的转录翻译。不同microRNA在不同的癌症中表达不同，同一个microRNA在不同的癌症表达也存在着差异，例如miR-365在CSCC及原发性乳腺癌中表达上调，而miR-365在胃癌、非小细胞肺癌、肝癌及黑色素细胞瘤却表达下调。已知多种microRNA可调控BAX表达。BAX属于BCL-2家族中的促凋亡蛋白，BAX蛋白的过表达、低表达和活化都会导致肿瘤生物学功能的改变。本课题的研究目的是探讨miR-365在CSCC中的生物学作用，进一步明确miR-365与BAX分子之间的调控机制，为CSCC的临床治疗提供理论依据和新的治疗策略。
　　方法:
　　①采用qPCR的方法检测人永生化表皮细胞与CSCC细胞系、人正常表皮组织与人皮肤鳞癌组织以及裸鼠移植瘤中miR-365和BAX的表达，采用WesternBlot检测BAX在蛋白水平上的表达;②免疫组化检测人正常表皮组织与人皮肤鳞癌组织以及裸鼠移植瘤中的BAX表达;③双荧光素酶实验等检测miR-365与BAX之间的靶向调控关系;④使用CCK8法、细胞划痕实验、细胞迁移实验和侵袭实验检测A431细胞转染NC、siBAX后，细胞的增殖能力、修复能力、迁移运动和侵袭能力的变化;⑤用流式细胞仪检测A431细胞转染NC、siBAX后，对细胞凋亡的影响;⑥Tunnel实验检测皮下移植瘤细胞中的凋亡情况。
　　结果:
　　①与对照相比，miR-365在CSCC细胞系中高表达(P＜0.001)，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低表达(P＜0.001)。②CSCC组织中，与正常表皮组织相比，BAX在mRNA水平以及蛋白水平低表达(p＜0.01)。免疫组化中BAX的阳性率低于正常表皮组织(P＜0.01)。③双荧光素酶实验表明，BAX.3'UTR-WT组的荧光强度明显低于BAX3'UTR-Mutant组(P＜0.01)。④分别将miR-365minic和antagomiR-365转染至A431细胞。miR-365组中miR-365表达上调，BAXmRNA水平及蛋白水平表达下调(P＜0.001);相反，antagomiR-365组中miR-365表达下调，BAX mRNA水平及蛋白水平表达上调(P＜0.001)。⑤转染NC、siBAX至A431细胞中，与对照NC相比，siBAX组细胞的增殖能力(P＜0.001)、修复能力(P＜0.05)、迁移（P＜0.001）及侵袭(P＜0.001)能力均增强，细胞凋亡减少(P＜0.05)。⑥裸鼠皮下成瘤初步实验揭示，与NC组相比，siBAX处理组的生长速度更快(P＜0.05)，肿瘤体积更大;种植瘤中BAX在mRNA水平和蛋白表达水平均低于对照组;免疫组化中，用siBAX处理组的BAX阳性率低于对照组(P＜0.05);Tunnel实验中，siBAX在肿瘤的凋亡率低于对照组。
　　结论:
　　①BAX在人CSCC细胞系以及肿瘤组织中的表达是下调的。②miR-365通过结合BAX的3'UTR区域，靶向下调BAX的表达。③BAX表达的降低使CSCC细胞的增殖、修复以及迁移和侵袭的能力增强，细胞凋亡减少;④体内实验证实BAX表达下调能够抑制皮肤鳞状细胞癌的凋亡并促进CSCC的进展。

目录

摘要

第1章 前言

1 microRNA

2 miR-365在不同肿瘤和疾病中发挥不同的作用

3 BAX与BCL-2家族成员

4 ABT-263抗凋亡蛋白抑制剂

第2章 材料和方法

1 材料

2 实验方法

第3章 结果

1 预测BAX为miR-365的靶标基因之一

2 BAX在CSCC细胞系以及人CSCC组织中表达下调

3 miR-365通过结合BAX的3’UTR区域，靶向下调BAX的表达

4 A431细胞BAX表达下调后，抑制其凋亡，促进增殖、迁移和侵袭

5 裸鼠皮下成瘤实验结果

第4章 讨论

全文小结

参考文献

硕士在读期间发表的论文

中英文缩略词

致谢

声明