低氧条件下缺氧诱导因子-1对胎鼠心肌细胞内钙离子转运的影响

摘要

背景:先天性心脏病（先心病）是目前中国最常见的出生缺陷，严重影响中国的人口质量，增加家庭和社会的负担。随着先心病的诊疗水平不断提高，国内外学者已将先心病的防治延伸到胎儿期，但是未能突破胎儿体外循环的技术障碍，包括良好的胎儿心肌保护，阻碍了胎儿心脏外科的发展。胎儿心肌细胞处于宫内低氧环境，与生后心肌保护可能存在差异。因此，低氧条件下的胎儿心肌保护机制是胎儿心脏外科发展中需要解决的重要环节。
　　目的:探讨低氧条件下缺氧诱导因子-1（HIF-1）对胎鼠心肌细胞内钙离子(Ca2+)转运的影响，为胎儿心肌保护奠定实验基础。
　　方法:取胎龄14～18d SD(Sprague-Dawley)大鼠胎鼠的心肌细胞置于含5％CO2，3％O2和92％N2的三气培养箱，在37℃下培养24h。实验分6组进行干预:对照组（1组），磷酸肌酸钠10μM（2组），HIF-1激动剂(DMOG)100μM（3组），磷酸肌酸钠10μM+DMOG100μM（4组），HIF-1抑制剂(Acriflavine)10μM（5组），磷酸肌酸钠10μM+Acriflavine10μM（6组），共同作用24h后，分别进行实时荧光定量PCR(real time-PCR)和免疫印迹分析(Western-blot)检测胎鼠心肌细胞HIF-1α、L型钙离子通道(L-type calcium channel，LCa)、T型钙离子通道(T-type calcium channel，TCa)、钠钙交换蛋白(Na+/Ca2+exchanger,NCX)、兰尼碱(Ryanodine)受体和肌质网Ca2+-ATP酶(Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a，SERCA2a)mRNA转录及蛋白表达水平。在激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞内钙离子(Ca2+)浓度的变化。
　　结果:Real-time PCR结果显示:药物干预和磷酸肌酸钠在HIF-1α、TCa、NCX、Rynaodinc受体mRNA转录水平上有交互作用，磷酸肌酸钠抑制药物干预的作用。没有磷酸肌酸钠作用的组间比较:3组的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受体的mRNA转录水平明显高于5组(P＜0.05，n=5)。磷酸肌酸钠作用的组间比较:4组的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受体的mRNA转录水平明显高于6组(P＜0.05，n=5)。药物干预和磷酸肌酸钠在LCa和SERCA2a的mRNA转录水平上无交互作用，但SERCA2a的mRNA转录水平在5组、6组显著大于1组、2组、3组和4组(P＜0.05，n=5)。Westernblot结果显示:药物干预和磷酸肌酸钠在各基因的蛋白表达上无交互作用，1组、2组的LCa的蛋白表达较3组、4组、5组和6组显著升高(P＜0.05，n=5)，SERCA2a的蛋白表达2组＞3组(P＜0.05)。钙瞬变荧光量测定结果显示药物干预和磷酸肌酸钠有交互作用，磷酸肌酸钠抑制药物干预产生的钙瞬变(P＜0.05，n=10)。
　　结论:低氧条件下HIF-1参与胎鼠心肌细胞内Ca2+转运的调节。过度激活HIF-1增强TCa、NCX和Rynaodine受体mRNA转录水平，降低SERCA2a mRNA转录水平，同时下调LCa的蛋白表达，从而增加细胞内的Ca2+超载。给予磷酸肌酸钠，抑制了HIF-1及其调节的Ca2+通路蛋白的mRNA水平，从而减轻细胞内的Ca2+超载。由此推断，抑制HIF-1活性、给予能量底物可能对胎儿心肌有保护作用。

目录

摘要

第一章 前言

2．1 实验药品及试剂

2．2 实验动物

2．3 实验仪器

第三章 实验方法

3．1 胎鼠心肌细胞原代培养

3．2 分组加药处理

3．3 荧光实时定量PCR

3．4 蛋白免疫印迹

3．5 Ca2+浓度动态变化测定

3．6 统计学方法分析

第四章 实验结果

4．1 胎鼠心肌细胞原代培养

4．2 与药物共同作用后的细胞生长情况

4．3 荧光实时定量PCR检测各基因mRNA转录水平

4．4 蛋白免疫印迹分析各基因蛋白水平

4．5 Ca2+浓度测定

第五章 讨论

5．1 钙离子调控生理

5．2 HIF-1的作用

5．3 磷酸肌酸钠对胎儿心肌的保护作用

第六章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间成果

综述 胎儿心肌细胞钙离子转运与心肌保护

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