FAM172A在大肠癌转移的作用机制研究

摘要

大肠癌(Colorectal Cancer，CRC)作为常见的人类恶性肿瘤，全世界每年大约120万新发病例，同时至少60万患者死亡。转移是影响大肠癌患者预后的重要原因，大多数伴有转移的大肠癌患者不适合传统治疗方式。大肠癌转移主要与个体基因突变有关，大肠癌中基因突变不超过50％，故可认定大肠癌的转移尚有其它新的抑癌基因或癌基因在起作用。FAM172A是本课题组前期研究发现的一个新基因，我们最近的研究结果证实:1）FAM172A在CRC相关组织中表达下调，且显著抑制人大肠癌LoVo细胞增殖和促进凋亡;2）转录因子STAT1在转录水平调控FAM172A表达，增强后者功能。综上所述，我们推测:FAM172A基因是一个典型的抑癌基因，进一步研究其转录调控相关机制具有重要意义。基因表达调控除发生在转录水平，转录后调控也是关键环节，miRNAs是近年来发现参与转录后水平调控的重要因子。miRNAs是一种由内源基因编码的、长度大概为22个核苷酸的非编码单链小RNA分子。研究证实miRNA异常表达与大肠癌转移相关，如miR-21在大肠癌细胞中表达明显增高，并通过抑制PDCD4表达促进肿瘤细胞的侵袭。我们前期工作中利用生物信息学预测发现miR-27a可能靶向结合FAM172A，故我们推测FAM172A功能可能在转录后水平受到miR-27a的调控。本课题拟在前期工作基础上，在转录后水平进一步阐明FAM172A抑制大肠癌侵袭转移的调控机制，为大肠癌的基因治疗提供科学依据和实验基础。
　　目的:
　　1、明确FAM172A对大肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响;
　　2、生物信息学筛选和验证调控FAM172A的重要miRNA;
　　3、明确大肠癌组织及细胞株中miR-27a表达水平及其相关临床意义;
　　4、探讨miR-27a靶向FAM172A对大肠癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制;
　　方法:
　　1、构建FAM172A重组质粒，通过细胞划痕及Transwell侵袭实验分别观察FAM172A对LoVo细胞迁移和侵袭的影响;
　　2、生物信息学筛选靶向FAM172A的重要miRNA，Luciferase报告基因技术验证两者结合关系;
　　3、RT-qPCR检测大肠癌细胞株及配对组织标本中miR-27a表达水平。
　　4、构建稳定过表达miR-27a的LoVo细胞株;细胞划痕及Transwell明确miR-27a调控FAM172A对大肠细胞迁移和侵袭影响;western blot检测miR-27a调控FAM172A对侵袭转移相关重要信号通路分子的表达影响;
　　5、数据统计采用SPSS22.0软件分析，以均数±标准误表示。计量资料组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为有统计学差异。所有实验均独立进行三次，取平均值进行统计分析。
　　结果:
　　1、过表达FAM172A减弱了LoVo细胞运动速度，引起LoVo细胞侵袭数量的减少，干扰FAM172A表达则加快了LoVo细胞运动速度，增加了其侵袭数量;
　　2、FAM172A3'UTR存在miR-27a结合位点且双荧光报告基因证实转染miR-27a能引起荧光素酶活性下降。
　　3、在大肠癌相关组织中miR-27a含量明显高于正常癌旁组织，临床病例资料分析显示其表达水平与TNM分期、淋巴结转移和远处转移与否呈正相关;miR-27a在各人大肠癌细胞株的表达均高于正常人大肠上皮细胞。
　　4、转染miR-27a导致LoVo细胞迁移加快和侵袭数量明显增加，干扰miR-27a表达则引起LoVo细胞迁移和侵袭数量减少;稳定过表达miR-27a的LoVo细胞在导入FAM172A过表达质粒后，LoVo细胞迁移减慢及侵袭细胞数量减少，且转移相关重要信号通路分子MMP-2、MMP-9和NF-κB的蛋白表达降低。
　　结论:
　　1、FAM172A抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭;
　　2、miR-27a靶向结合FAM172A;
　　3、miR-27a的表达变化对诊断和评估CRC患者病情具有一定的价值;
　　4、FAM172A抑制大肠癌细胞株LoVo细胞迁移和侵袭活性的功能受到miR-27a负性调控，且可能通过下游NF-κB信号通路而实现。

目录

摘要

第一部分 FAM172A对大肠癌细胞迁移和侵袭的影响

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二部分 靶向调控FAM172A的miRNAs的筛选

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 在大肠癌细胞及组织中miR-27a的表达及其意义

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 miR-27a靶向FAM172A对CRC侵袭转移的作用及其机制

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 结论

参考文献

英文缩略词

攻读硕士学位期间发表论文

致谢

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